大鼠脊髓损伤后5-HT1D受体的表达及相关痉挛机制研究
脊髓损伤（spinalcordinjury，SCI）是常见的致残率、致死率较高的疾病，严重威胁人类健康，随着经济和交通业的不断发展有逐年增高趋势。SCI患者并发痉挛约占SCI总数的70%左右。痉挛是以速度依赖的紧张性牵张反射（肌张力）增强伴腱反射亢进为特征的运动功能障碍。痉挛会引发许多问题如肌肉纤维化、疼痛、关节僵硬、甚至挛缩等影响患者的功能恢复和生活质量，加重护理负担，是亟待解决的医学难题。目前SCI后痉挛的治疗方法较多，对痉挛缓解有一定的疗效，但都存在一些问题。为实现更好的痉挛治疗，痉挛机制研究和新的药物靶点寻找显得尤为关键。 SCI后痉挛机制较为复杂，尚不明确。有研究认为重要的痉挛机制之一是SCI后单胺类神经递质5-羟色氨（5-hydroxytryptamine，5-HT）通过激活其受体产生持续性内向电流，从而使运动神经元持续性放电而导致痉挛。文献报道和本课题组前期研究发现，SCI能够诱导芳香族氨基酸脱羧酶（aromaticl-aminoaciddecarboxylase，AADC）细胞发生功能改变，利用外源性5-羟色氨酸（5-hydroxytryptophan，5-HTP）合成5-HT，合成的5-HT能够增加运动神经元的兴奋性产生痉挛，且发现SCI后AADC细胞产生5-HT的机制与发挥负反馈调节作用的5-HT1受体家族的自身受体5-HT1B受体相关（自身受体5-HT1A受体不发挥作用），但5-HT1B受体激活后只能抑制AADC细胞29%的活性，我们推测5-HT1受体家族其他自身受体如5-HT1D受体可能也参与这个过程。目前，关于SCI后不同时间点5-HT1D受体表达特征、5-HT1D受体表达与痉挛发展的相关性及5-HT1D受体是否参与AADC细胞功能改变均未见文献报道。 本研究通过建立大鼠脊髓骶2（sacral2，S2）全横断尾部痉挛模型，重点观察大鼠SCI后2d、5d、14d、28d和60d不同时间点大鼠尾部痉挛评分和5-HT1D受体表达特征；分析SCI后大鼠尾部痉挛评分和5-HT1D受体表达相关性；探究5-HT1D受体是否参与调节SCI后AADC细胞合成5-HT的痉挛机制。通过本课题研究，旨在为SCI后痉挛机制的深入研究奠定基础，为临床SCI后痉挛的靶向治疗研究提供新的思路。 目的： 通过建立大鼠脊髓S2全横断尾部痉挛模型，研究SCI后不同时间点大鼠尾部痉挛的行为学变化特征和5-HT1D受体表达特征，分析痉挛与5-HT1D受体表达的关系；探究5-HT1D受体是否参与AADC细胞功能改变产生5-HT的机制；为SCI后痉挛机制的进一步研究奠定基础，为SCI后痉挛临床治疗靶点研究提供新的思路。 方法： 健康雄性Wistar大鼠164只，体质量（200±20）g，随机选取其中84只大鼠进行脊髓S2全横断手术（SCI），66只大鼠进行假手术（Sham），14只健康正常大鼠。 1.术后五个不同时间点（2d、5d、14d、28d、60d），每个时间点均随机选取假手术Sham组大鼠12只、SCI组大鼠12只，首先进行大鼠尾部痉挛评分，随后提取所有大鼠S2以下的S3~尾2（caudal2，Ca2）新鲜脊髓组织，然后分别应用Westernblotting技术检测脊髓组织5-HT1D受体蛋白表达（n=6）、qRT-PCR技术检测5-HT1D受体mRNA表达（n=6）。 2.SCI后大鼠尾部痉挛评分与5-HT1D受体表达之间进行相关分析。 3.术后60d，SCI大鼠进行尾部痉挛评分，随机筛选出评分4~5分SCI大鼠6只和Sham组60d大鼠6只，多聚甲醛灌注后取大鼠脊髓S3~Ca2组织进行5-HT1D受体的免疫荧光检测。另取2只正常大鼠仅用于免疫荧光的对照染色。 4.术后60d，SCI大鼠进行尾部痉挛评分，随机筛选出评分4~5分的SCI大鼠12只，其中随机6只作为5-HT1D受体激动剂组、6只作为5-HT1D受体激动剂对照组；12只正常大鼠，随机6只作为5-HT1D受体拮抗剂组、6只作为5-HT1D受体拮抗剂对照组。5-HT1D受体激动剂组和对照组，连续8天皮下分别注射激动剂L694247和生理盐水，5-HT1D受体拮抗剂组和对照组连续8天皮下分别注射拮抗剂LY310762和生理盐水后，每只大鼠腹腔注射5-HTP，应用免疫荧光双标法检测S3~Ca2脊髓中AADC细胞中5-HT阳性细胞的表达率。 结果： 1.SCI后不同时间点大鼠尾部痉挛评分的检测结果 于术后2d、5d、14d、28d、60d时，Sham组大鼠尾部痉挛评分分别为0.17±0.02，0.19±0.02，0.22±0.02，0.22±0.01，0.21±0.01；SCI组大鼠尾部痉挛评分分别为0.00±0.00，0.59±0.05，1.62±0.05，3.09±0.22，4.42±0.14。 2.SCI后不同时间点5-HT1D受体的蛋白和mRNA表达结果 不同时间点2d、5d、14d、28d、60d时，Sham组大鼠脊髓5-HT1D受体的蛋白表达分别为0.63±0.06，0.59±0.04，0.59±0.04，0.64±0.13，0.60±0.05；SCI组大鼠脊髓5-HT1D受体的蛋白表达分别为0.52±0.06，0.33±0.09，0.37±0.05，0.50±0.09，0.52±0.05。不同时间点，与Sham组相比，SCI组大鼠脊髓中5-HT1D受体的蛋白表达水平均降低（Plt;0.05）。 不同时间点2d、5d、14d、28d、60d，Sham组大鼠脊髓中5-HT1D受体的mRNA相对表达量分别为1.02±0.09，1.04±0.07，1.05±0.06，1.01±0.07，1.07±0.11；SCI组在大鼠脊髓中5-HT1D受体mRNA相对表达量分别为0.28±0.04，0.50±0.06，0.56±0.04，0.69±0.03，0.79±0.06。不同时间点，与Sham组相比，SCI组大鼠脊髓中5-HT1D受体的mRNA表达水平均降低（Plt;0.05）。 3.相关性分析结果 术后5d随时间延长，Westernblotting检测的5-HT1D受体蛋白表达与大鼠尾部痉挛评分正相关（r=0.97，Plt;0.05）。术后2d随时间延长，5-HT1D受体的mRNA表达与大鼠尾部痉挛评分正相关（r=0.95，Plt;0.05）。 4.免疫荧光染色检测大鼠脊髓中5-HT1D受体表达结果 （1）5-HT1D受体分布：5-HT1D受体在正常大鼠的脊髓S3~Ca2中，广泛分布在脊髓背角（dorsalhorn，DH）、中央带（theintermediatezone，IMZ）和腹角（ventralhorn，VH）。浅层DH中5-HT1D受体主要在纤维中表达，DH、IMZ和VH区域的神经元中均可见5-HT1D受体表达。Sham组和SCI组大鼠的脊髓S3~Ca2中，5-HT1D受体的分布方式与正常大鼠相似。 （2）SCI后60d大鼠脊髓的5-HT1D受体表达结果：Sham组大鼠5-HT1D受体在脊髓灰质中光密度值为22.55±1.13，SCI组大鼠5-HT1D受体在脊髓灰质中光密度值为13.33±0.50。与Sham组相比，SCI组大鼠脊髓灰质中5-HT1D受体的光密度值降低（Plt;0.05）。SCI后60d，Sham组大鼠5-HT1D受体在脊髓灰质的DH、IMZ和VH光密度值分别为21.91±1.70、23.72±1.31、22.91±1.51，SCI组大鼠5-HT1D受体在脊髓灰质的DH、IMZ和VH光密度值分别为13.15±0.53、13.83±0.83、13.66±0.62。与Sham组相比，SCI组大鼠脊髓灰质的DH、IMZ和VH中5-HT1D受体的光密度值均降低（Plt;0.05）。 5.5-HT1D受体激动剂和拮抗剂干预后，AADC细胞中5-HT表达结果 （1）AADC细胞的分布与表达： 5-HT1D受体拮抗剂组、5-HT1D受体拮抗剂对照组、5-HT1D受体激动剂组和5-HT1D受体激动剂对照组，所有大鼠脊髓S3~Ca2中AADC细胞分布方式相似，主要分布在脊髓灰质的DH、IMZ和CC周围等区域表达，DH区域的AADC细胞最为密集。四组统计AADC阳性细胞总数量，各组相比无统计学差异（Pgt;0.05）。 （2）5-HT1D受体拮抗剂干预正常大鼠后，脊髓S3~Ca2中AADC细胞表达5-HT阳性细胞的情况： 5-HT1D受体拮抗剂组和对照组：5-HT1D受体拮抗剂组大鼠脊髓中，可见AADC细胞中5-HT的阳性表达率是（1.31±0.15）%。对照组脊髓中未见5-HT阳性细胞，仅见大量5-HT纤维，AADC细胞中5-HT的阳性表达率是（0.00±0.00）%，两组之间比较有统计学差异（Plt;0.05）。 （3）5-HT1D受体激动剂干预慢性SCI大鼠后，脊髓S3~Ca2中AADC细胞表达5-HT阳性细胞的情况： 5-HT1D受体激动剂组和对照组：在脊髓中，5-HT1D受体激动剂组和对照组AADC细胞中5-HT的阳性表达率分别是（12.97±1.60）%和（46.06±7.70）%，两组之间比较有统计学差异（Plt;0.05）。 结论： 1.大鼠脊髓S2完全损伤后不同时间点（2d、5d、14d、28d、60d），5-HT1D受体表达均降低。 2.大鼠SCI后5-HT1D受体表达变化与痉挛发展正相关。 3.在正常、Sham和SCI大鼠脊髓S2节段以下，5-HT1D受体不仅表达在脊髓的DH浅层纤维中，也表达在DH、IMZ和VH的神经元中。 4.5-HT1D受体通过负反馈作用调节SCI后AADC细胞产生5-HT的机制。
脊髓损伤;5-羟色氨1D受体;免疫荧光;芳香族氨基酸脱羧酶;痉挛机制研
承德医学院
硕士
病理学与病理生理学
任立群
2021
中文
R651.2
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）