基于PERK通路探讨补阳还五汤抑制内质网应激介导的细胞凋亡减轻脑缺血再灌注损伤
脑缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤是恢复再通缺血区血供时常见的病理生理改变，受再灌注时间、强度等多方面因素的影响，与炎症反应、细胞自噬和凋亡等多重机制有关。近年来研究发现，内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）介导的细胞凋亡在脑I/R损伤的发生发展中起着重要作用，并决定脑组织的最终梗死体积。葡萄糖调节蛋白78（glucoseregulatedprotein78kD，GRP78）是ERS发生的标志性蛋白，检测其表达可有效反应ERS状态。检测PERK通路和Bcl-2家族相关蛋白等可有效反映ERS介导的细胞凋亡。 缺血性卒中归属于中医的“中风”，该病的主要病机为气虚血瘀。补阳还五汤（BuyangHuanwudecoction，BYHWD）是传统医学治疗中风气虚血瘀证的代表方剂，且在临床已取得了肯定的疗效。BYHWD可减轻大鼠脑I/R损伤已被多项实验证实，但ERS介导的细胞凋亡是否参与了BYHWD抗脑I/R损伤未见报道。本研究利用大鼠构建大脑中动脉闭塞模型模拟脑I/R损伤，通过观察比较大鼠行为学改变、神经细胞病理形态学变化，ERS超微结构改变，以及ERS蛋白GRP78和凋亡相关蛋白的表达来探讨BYHWD对脑I/R大鼠神经损伤、ERS和细胞凋亡表达的影响。同时利用PC12细胞构建缺氧缺糖/复氧复糖模型模拟脑I/R损伤，给予PERK抑制剂干预后，通过检测PERK信号通路相关蛋白探讨BYHWD基于PERK信号通路抑制ERS介导的细胞凋亡对脑I/R损伤的影响。 第一部分补阳还五汤对脑缺血再灌注大鼠神经损伤、内质网应激蛋白GRP78和细胞凋亡蛋白表达的影响 目的： 探讨补阳还五汤对脑缺血再灌注（I/R）大鼠神经损伤、内质网应激蛋白GRP78和细胞凋亡蛋白表达的影响。 方法： 1.将雄性SD大鼠（120只）随机分为假手术组（20只）和手术组（100只）。手术组大鼠通过建造MCAO模型模拟脑I/R损伤。将手术组大鼠随机进行脑缺血2h后再灌注24h（50只）和72h（50只）处理。将再灌注24h和72h造模成功的大鼠分别随机分为模型组、BYHWD组和尼莫地平组。BYHWD组在术后给予汤药灌胃处理（14.3g·kg-1），日2次；尼莫地平组给予腹腔注射给药（10mg·kg-1），日1次。 2.通过ZeaLonga评分法观察各组大鼠不同时间点神经功能缺损情况进行模型筛选和药效观察；TTC染色法检测再灌注24h大鼠脑梗死体积；甲苯胺蓝法观察再灌注24h时神经细胞的病理形态和数量改变；苏木素-伊红（HE）法观察再灌注72h时神经细胞的病理形态改变；透射电镜法观察再灌注72h时内质网超微结构病变；WesternBlot法检测ERS蛋白GRP78不同时间点的表达差异及再灌注72h时细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3的表达。 3.数据分析 所有实验数据均采用GraphPadPrism8.0.2软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果： 1.模型成功率：共100只大鼠通过随机抽样的方式纳入手术组，通过ZeaLonga评分法进行模型筛选，其中1-3分者82只，模型成功率为82%。 2.神经功能缺损评分结果：假手术组大鼠评分为0，活动自如，无行为学改变；与假手术组相比，模型组大鼠评分显著升高，活动受限，出现神经功能受损改变（Plt;0.05）；与模型组比较，BYHWD组评分有所下降，功能改善（Plt;0.05），尼莫地平组评分也低于模型组（Plt;0.05）。 3.TTC染色结果显示：正常脑组织呈红色，梗死区呈白色。假手术组皆为红色，无白色梗死区；模型组出现大面积白色梗死区（Plt;0.05）；与模型组相比，BYHWD组和尼莫地平组白色梗死区域减少（Plt;0.05）。 4.甲苯胺蓝法染色结果显示：假手术组神经细胞形态规整，胞核呈近圆形，核膜光滑完整，细胞数量丰富；与假手术组相比，模型组神经细胞出现变形，胞核呈不规则状，核碎裂，神经细胞数量显著减少（Plt;0.05）；与模型组相比，BYHWD组神经细胞形态趋于规整，胞核清晰可见，呈近圆形，核膜完整，神经细胞数量较多（Plt;0.05）。 5.HE染色结果显示：胞质与背景呈不同程度的粉红色，胞核为浅蓝色，核仁为一粒深蓝色的斑点，若出现染色质凝聚固缩可见深蓝色的斑块。结果显示：假手术组神经细胞形态规整，胞核近圆形、呈浅蓝色，核膜光滑完整，中间可见一粒深蓝色的核仁，个别细胞内可见胞核内染色质凝聚深染的深蓝色斑块；与假手术组比，模型组神经细胞出现变形，胞核形状不规则，浅蓝色细胞核较少，核膜破裂，未见或少见核仁，有深蓝色斑块的染色质凝固现象；与模型组相比，BYHWD组细胞形态得到改善，趋于规整，胞核近圆形，核膜光滑完整，中间可见核仁，部分细胞有深蓝色斑块的染色质凝聚现象。 6.透射电镜超微结构显示：假手术组粗面内质网形态规整，有大量核糖体附着；与假手术组相比，模型组粗面内质网扩张严重，且伴有核糖体脱落；与模型组相比，BYHWD组和尼莫地平组粗面内质网扩张程度减轻，且有较为丰富的核糖体。 7.WesternBlot法检测ERS蛋白GRP78再灌注24h、72h结果显示：假手术组在不同时间均呈低表达；与假手术相比，GRP78在模型组表达量显著升高（Plt;0.05）；与模型组相比，BYHWD组在再灌注24h时表达升高（Plt;0.05），再灌注72h时表达降低（Plt;0.05）；尼莫地平组与BYHWD组呈相同趋势。 8.WesternBlot法检测再灌注72h凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3结果显示：与假手术组比较，上述蛋白在模型组的表达显著增加（Plt;0.05）；与模型组相比，Bax/Bcl-2、Caspase-3在BYHWD组表达量降低（Plt;0.05），在尼莫地平组表达也降低（Plt;0.05）。 小结： 补阳还五汤可改善MCAO模型大鼠的神经功能，减小脑梗死体积，改善细胞形态，减轻细胞超微结构改变，同时可在缺血再灌注24h时增加GRP78的表达，在缺血再灌注72h时可抑制GRP78的表达，降低细胞凋亡相关蛋白Bax/bcl-2和Caspase-3的表达。推测补阳还五汤可能通过抑制ERS介导的细胞凋亡减轻脑I/R损伤。 第二部分补阳还五汤基于PERK通路抑制内质网应激介导的细胞凋亡减轻PC12细胞缺氧缺糖/复氧复糖损伤的机制研究 目的： 探讨补阳还五汤基于PERK信号通路抑制ERS介导的细胞凋亡对PC12细胞缺氧缺糖/复氧复糖（OGD/R）损伤的影响。 方法： 1.将PC12细胞随机分为正常组、不同浓度BYHWD含药血清组（1/10、1/100、1/500、1/1000、1/5000）和不同浓度阴性对照组（1/10、1/100、1/500、1/1000、1/5000）。正置显微镜观察各组细胞生长状态；待细胞密度达90%后，CCK-8法检测各组细胞活性，通过比较各组细胞的OD值观察BYHWD含药血清对正常PC12细胞活性的影响。 2.将PC12细胞随机分为正常组、模型组、不同浓度BYHWD含药血清组（1/10、1/100、1/500、1/1000、1/5000）、不同浓度阴性对照组（1/10、1/100、1/500、1/1000、1/5000）。除正常组，其余3组进行缺氧缺糖2h、复氧复糖24h的OGD/R模型建造模拟脑I/R损伤。利用CCK-8法检测各组细胞活性，通过比较细胞的OD值观察BYHWD含药血清对PC12细胞OGD/R活性的影响并筛选出有效浓度。 3.将PC12细胞随机分为正常组、模型组、PERK抑制剂组、BYHWD组和阴性对照组。除正常组，其余4组进行缺氧缺糖2h、复氧复糖24h模型建造。利用免疫组化法检测PERK信号通路蛋白p-eIF2α的表达，通过比较阳性细胞表达率、观察有无染色质凝集固缩的细胞凋亡现象检测BYHWD对PERK信号通路的影响。（阳性细胞个数/细胞总数=阳性细胞表达率） 4.数据分析 所有实验数据均采用GraphPadPrism8.0.2软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果： 1.不同浓度BYHWD药物血清对正常PC12细胞的生长形态影响：正常组细胞形态规整，突触完整呈梭形，胞核呈近圆形，折光性好；与正常组相比，不同浓度BYHWD药物血清组、不同浓度阴性对照组细胞状态良好，形态均无明显变化。 2.BYHWD含药血清对正常PC12细胞生长活性的影响：CCK-8检测出的OD值代表细胞活性。与正常组相比，不同浓度BYHWD药物血清组、不同浓度阴性对照组的OD值均无显著差异（Pgt;0.05），说明BYHWD药物血清对正常PC12细胞的活性无影响。 3.BYHWD药物血清对PC12细胞OGD/R活性的影响：OD值代表细胞活性。正常组的OD值最高，表示该组的细胞活性最好；与正常组相比，模型组OD值下降，活性显著降低（P＜0.05）；与模型组比，BYHWD1/500浓度药物血清组OD值升高，细胞活性提高（P＜0.05），其余各组细胞活性无明显升高，阴性对照不同浓度组活性也未明显高于模型组，说明BYHWD药物血清可有效减轻PC12细胞OGD/R损伤，且有效浓度为1/500。 4.BYHWD对PERK信号通路的影响：细胞核为蓝色，p-eIF2α阳性表达为棕黄色，细胞核内深蓝色斑块为可能为染色质凝集（为细胞凋亡的病理形态特征）。染色结果显示：正常组少量细胞出现棕黄色沉淀，阳性细胞表达率较低，未见深蓝色斑块的染色质凝聚现象；与正常组相比，模型组细胞胞浆部位皆出现棕黄色沉淀，阳性细胞表达率显著高（P＜0.05），可见细胞核出现染色质凝聚的深蓝色斑块；与模型组比，PERK抑制剂组有棕色颗粒的细胞数减少，阳性细胞率降低（P＜0.05），蓝色深染细胞减少；与模型组比，BYHWD药物血清组部分细胞出现棕黄色颗粒，阳性表达率降低（P＜0.05），少量细胞出现细胞核深染、染色质凝聚，细胞凋亡形态表现减轻；阴性对照组与模型组细胞活性无显著差异。 小结： 补阳还五汤含药血清有效浓度为1/500，可增强OGD/RPC12细胞活性，降低p-eIF2α细胞阳性表达，减轻细胞凋亡，表明补阳还五汤含药血清可减轻PC12细胞OGD/R损伤，其可能与抑制PERK通路、下调p-eIF2α的表达，降低ERS介导的细胞凋亡有关。 结论： 1、补阳还五汤可改善MCAO模型大鼠的神经功能，减小脑梗死体积，改善细胞形态，减轻细胞超微结构改变，同时可在缺血再灌注24h时增加GRP78的表达，在缺血再灌注72h时可抑制GRP78的表达，降低细胞凋亡相关蛋白Bax/bcl-2和Caspase-3的表达。推测补阳还五汤可能通过抑制ERS介导的细胞凋亡减轻脑I/R损伤。 2、补阳还五汤含药血清有效浓度为1/500，可增强OGD/RPC12细胞活性，降低p-eIF2α细胞阳性表达，减轻细胞凋亡，表明补阳还五汤含药血清可减轻PC12细胞OGD/R损伤，其可能与抑制PERK通路、下调p-eIF2α的表达，降低ERS介导的细胞凋亡有关。
脑缺血再灌注损伤;补阳还五汤;内质网应激;PERK通路;细胞凋亡
承德医学院
硕士
病理学与病理生理学
高维娟
2021
中文
R285.5;R743.3
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）