H1N1流感病毒血凝素对内皮细胞ICAM-1、VCAM-1及E-选择素表达的影响
目的:从上个世纪至今,甲型流感病毒已造成四次世界范围内的流感大流行,其中包括:1918年西班牙H1N1流感、1957年亚洲H2N2流感、1968年香港H3N2流感及2009年墨西哥H1N1流感;每间隔几十年甲型流感病毒就会出现一次全球范围的大流行,对人类健康及社会经济产生了严重影响。目前甲型流感病毒常以季节性及小范围流行的形式出现,继续对人类产生威胁。甲型流感病毒属于正黏病毒科,其基因组是由8条单股负链RNA组成。由于其基因组的不稳定性而形成抗原漂移及抗原转变,最终导致季节性流感及大流行出现。在未来,流感大流行的出现更加难以预测,因而我们需要为下一次流感大流行的到来做好充足准备。目前预防和治疗流感病毒感染的主要药物是流感病毒疫苗、M2离子通道阻断剂(金刚烷胺)及神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦)等等,M2离子通道阻断剂作为最早出现的抗流感病毒药物,在治疗流感病毒感染发挥了重要作用;然而随着流感病毒的不断变异,到目前为止绝大部分病毒毒株对它已产生耐药。神经氨酸酶抑制剂作目前作为抗流感病毒的首选药,然而在国内部分地区也报道过个别患者耐药情况的出现。同时神经氨酸酶抑制剂在流感病毒感染48h内治疗效果明显,而对重症流感患者体内各种不可逆的病理损伤的治疗收效甚微。因此人们还需要对流感病毒的致病机制进一步研究,致力于研发更有效的治疗药物。 H1N1流感病毒通过呼吸道传播,导致一系列病理变化。轻者可出现咳嗽、咳痰、发热等类似感冒的上呼吸道症状;严重可导致肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征(Acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)、多器官功能障碍综合征(Multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS)。流感病毒损伤机制可能涉及肺上皮细胞细胞凋亡及坏死、免疫功能的激活、凝血功能异常与微血栓的形成等等。免疫功能的紊乱在各种病理改变中起到中心环节作用,其主要包括:过度炎症细胞浸润及高细胞因子血症。动物实验证实甲型流感病毒感染小鼠可促进肺组织炎症反应,包括各种炎症细胞(单核巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞)的局部浸润及各种炎症介质的释放,并且中性粒细胞及单核巨噬细胞的浸润与肺组织损伤的程度密切相关。在临床研究中也发现流感病毒患者血清可检测到各种细胞因子及趋化因子的高表达。其中IL-6和趋化因子CCL-2、CCL-4、CXCL-8、CXCL-9和CXCL-10与流感病毒的致病性有关。趋化因子CCL-2、CXCL-8、CXCL-9、CXCL-10也与流感患者死亡率相关。细胞因子及趋化因子是免疫反应重要的活性介质。一方面可以通过直接激活细胞内多种酶活性杀伤病原体,另一方面诱导免疫细胞参与免疫反应。在甲型流感病毒感染期间,免疫细胞-细胞因子之间平衡遭到破坏,导致炎症反应的恶性循环,组织损伤的加重。 流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)是存在于流感病毒表面的一种刺突蛋白,同时也是维持流感病毒生存的重要成分。最早的研究发现它能够结合靶细胞表面唾液酸受体参与病毒的粘附过程,并且在病毒与靶细胞膜融合的过程具有重要作用。HA对于机体免疫系统是一种重要的抗原,在流感病毒介导病理损伤中具有重要作用。有研究证实H5N1重组血凝素可以异常激活宿主体内固有免疫系统导致各种细胞因子和趋化因子过度释放,进而诱导肺部严重病理改变。而本研究主要通过探讨HA对血管内皮细胞细胞间黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)、血管黏附分子-1(Vascularadhesionmolecule1,VCAM-1)及E-选择素(E-selectin)表达的影响以及病毒血凝素与炎症反应的关系,从而揭示HA致病的可能机制。 研究内容及方法: 第一部分:H1N1流感病毒血凝素对血管内皮细胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1及E-选择素)表达的作用 1.1将人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalvein endothelialcells,HUEVC)进行培养及种板后随机分为三组。第一组:空白对照组;第二组:1.25ug/mlHA组;第三组:2.5ug/mlHA组。各组细胞在不同浓度HA作用3小时后,分别提取各组细胞总蛋白,并通过Westernblotting检测ICAM-1、VCAM-1及E-选择素在蛋白水平上的变化。 1.2培养HUEVC细胞及种板后随机分为三组。第一组:空白对照组;第二组:1.25ug/mlHA组;第三组:2.5ug/mlHA组。各组细胞在不同浓度HA作用3小时后,分别提取各组细胞的总RNA,并通过Real-timePCR检测ICAM-1、VCAM-1及E-选择素在基因水平上的变化。 第二部分:单核细胞与HA处理后的血管内皮细胞之间的黏附作用 1.3培养HUEVC细胞及种板后随机分取三组,第一组:空白对照组;第二组:1.25ug/mlHA组;第三组:2.5ug/mlHA组。各组细胞在不同浓度HA作用3小时后,并与钙黄绿素染料染色后的单核细胞(humanmyeloidleukemiamononuclearcells,THP1)共培养1h,并在荧光显微镜下观察各组单核细胞与内皮细胞粘附反应情况。 结果: 第一部分:H1N1病毒血凝素诱导血管内皮细胞表达ICAM-1、VCAM-1及E-选择素。 Real-timePCR及Westernblotting结果:ICAM-1及VCAM-1的mRNA和蛋白表达随HA浓度升高表达增多。当HA浓度为2.5ug/ml时,ICAM-1及VCAM-1的mRNA和蛋白表达相对于空白对照组明显增加(P<0.05)。而当HA浓度为1.25ug/ml时E-选择素的mRNA和蛋白的表达相对于空白对照组明显增加(P<0.05)。 第二部分:H1N1病毒血凝素促进血管内皮细胞与单核细胞的粘附作用。 粘附实验结果:1.25ug/ml及2.5ug/mlHA组相对于空白对照组单核细胞粘附数目显著增加(P<0.05),并且2.5ug/mlHA组相对于1.25ug/mlHA组细胞粘附数目显著增加(P<0.05)。 结论 1.流感病毒血凝素可以促进内皮细胞ICAM-1、VCAM-1及E选择素的表达 2.流感病毒血凝素可以促进单核细胞与内皮细胞的黏附反应。
流感病毒;病毒血凝素;ICAM-1;VCAM-1;E-选择素;内皮细胞
承德医学院
硕士
内科学
张庆
2021
中文
R373.13
2021-11-17(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)