原肌球调节蛋白1(Tmod1)对肾脏集合管细胞中AQP2表达和定位的影响及机制分析
肾脏对水重吸收的能力对维持人体水稳态至关重要。水平衡和相关疾病的改变与血管加压素-水通道-2（AVP-AQP2）的激活状态密切相关。研究发现许多因子通过对AQP2膜转运的调节参与到肾脏集合管对水的重吸收过程中。其中细胞骨架对AQP2转运机制的调节逐渐受到人们重视。本文①将研究作为在肾脏中表达的细胞骨架蛋白--原肌球蛋白调节蛋白1（Tropomodulin1，Tmod1）对肾脏集合管细胞中AQP2表达和转运的影响及其机制。 目的: 探讨Tmod1是否可通过参与调节肾脏中AQP2的转运来维持机体水稳态？如果是，其参与方式是通过与AQP2直接相互作用还是通过与其它蛋白的相互作用来实现？ 方法： 我们首先在小鼠肾脏原代内髓集合管细胞中给予高渗处理模拟禁水后髓质的高渗环境，并检测Tmod1的变化；并通过在原代内髓集合管细胞及稳定表达AQP2的M-1细胞系中利用腺病毒过表达或敲除Tmod1后，检测总AQP2及其s256处磷酸化的变化；利用腺病毒过表达或敲除Tmod1后，分别给予低渗、高渗处理，观察Tmod1对细胞膜通透性变化的影响；并用腺苷酸环化酶的激动剂Forskolin处理后，利用免疫荧光，检测AQP2转运情况；利用生物素标记膜蛋白的方法，检测过表达或敲除Tmod1后AQP2在膜上的表达变化；我们还利用免疫沉淀的方法，验证与Tmod1可能存在相互作用的蛋白，如CDK1。随后在原代内髓集合管细胞中过表达或敲除Tmod1后检测CDK1表达变化，并在肾脏特异性敲除小鼠Tmod1flox/flox/Ksp-Cre+(TFK)及其Tmod1flox/flox/Ksp–Cre–(TF)小鼠肾脏总蛋白中进行验证。 结果： 在原代内髓集合管细胞中给予高渗处理后Tmod1RNA及蛋白水平均增加；腺病毒过表达Tmod1后过表达Tmod1后总AQP2及其S256处磷酸化在蛋白水平均、细胞膜的通透性均显著增加；利用腺苷酸环化酶的激动剂Forskolin处理后，发现Tmod1过表达可以显著促进AQP2在膜上的聚集；通过使用生物素标记膜上蛋白发现，过表达Tmod1后，AQP2在膜上表达增加。相反，敲低Tmod1可以降低总AQP2及其S256处磷酸化在蛋白水及AQP2在膜上的表达，并降低细胞膜的通透性。在原代内髓集合管细胞中过表达Tmod1后进行免疫共沉淀发现Tmod1与CDK1之间可能存在相互作用；体外实验显示，在原代内髓集合管细胞中过表达或敲除Tmod1后，CDK1蛋白水平也随之发生变化，其变化呈正相关。并与CDK1在TFK及TF小鼠肾脏组织蛋白中的表达变化一致。 结论： Tmod1可通过影响水通道蛋白AQP2的表达及转运而促进AQP2在顶端膜上的聚集，在肾脏水调节中发挥作用。其机制可能是Tmod1通过影响与AQP2存在相互作用的蛋白的稳定性进而影响AQP2的磷酸化来实现。这提示Tmod1可作为防治以水平衡失调为特征的疾病的新靶点。
原肌球蛋白调节蛋白1;水通道蛋白;细胞骨架;机体水平衡;肾脏集合管细胞
承德医学院
硕士
人体解剖与组织胚胎学
谢利德;姚伟娟
2021
中文
R334.1
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）