丝胶通过miR-30a-5p靶向Snai1对高糖诱导小鼠足细胞EMT的影响
糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是一种慢性进行性肾病，是由糖尿病（diabetesmellitus，DM）引起的最重要的肾脏微血管病变之一，最终会发展为终末期肾病（end-stagerenaldisease，ESRD）。DN患者早期最主要的临床表现是出现微量白蛋白尿，已有多项研究证实，在高血糖、氧化应激、炎症因子释放等因素刺激下，肾小球足细胞会启动上皮间质转分化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）过程，此时附在肾小球基底膜（glomerularbasementmembrane，GBM）外表面的足细胞会脱落，肾小球滤过膜的完整性被破坏，导致蛋白尿的产生。因此提示，减轻足细胞EMT可延缓DN的进展。 微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类长度约18～22bp的非编码小分子RNA，主要通过与靶基因信使RNA（messengerRNA，mRNA）的3''端非翻译区(3''-UTR)结合，调控基因表达。miRNA的异常表达在DM及DN的发生发展过程中起着重要的调控作用。有研究发现，miR-30家族（miR-30a~e）在DN患者的足细胞中均有明显下调，且上调miR-30的表达后还可靶向偶联蛋白2抑制肾小管上皮细胞EMT。此外，Snai1是调控EMT的关键分子，miR-30a-5p是否通过靶向Snai1参与足细胞EMT有待进一步探究。 丝胶是蚕丝中包被在丝素外围的天然高分子水溶性蛋白，主要由18种氨基酸组成，分子量为10-300kd，有抗氧化、抑癌等医用功效。本课题组前期研究发现，丝胶能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖、保护DM时肾脏损伤，但丝胶发挥作用的机制仍需探讨。 第一部分：高糖致损伤小鼠足细胞模型的建立 目的： 鉴定培养的小鼠足细胞是否成熟，并通过检测足细胞表面标记蛋白Nephrin的表达水平，确定是否成功建立高糖致损伤小鼠足细胞模型。 方法： 137℃培养足细胞成熟的鉴定：将33℃培养的足细胞撤IFN-γ，37℃培养10-14d左右，倒置显微镜下观察；使用细胞免疫荧光—间接法，在正置荧光显微镜下观察37℃培养第3d及第14d时Nephrin蛋白在足细胞中的定位表达，以判断足细胞是否成熟。 2待足细胞分化成熟后，取处于对数生长期的细胞进行实验。以1×105个/孔足细胞接种于六孔板中，同步化处理12h后，不同培养基作用48h。足细胞分组如下： (1)NG组（正常组：5.5mmol/LD-葡萄糖）； (2)MG组（高渗对照组：5.5mmol/LD-葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇）； (3)HG组（高糖损伤组：30mmol/LD-葡萄糖）。 3应用蛋白免疫印迹法（Westernblot法）检测足细胞Nephrin蛋白的表达。 4应用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR技术）检测足细胞NephrinmRNA的表达。 结果： 1.足细胞的形态结构 1.1不同培养温度下足细胞的形态结构 33℃增殖态：生长活跃的足细胞体积中等，为多边形，无突起伸出，细胞迅速生长至融合状态，呈铺路石样外观，为去分化状态的足细胞；37℃分化态：消化传代后的足细胞继续生长，胞体和胞核较增殖状态时显著增大，自胞体伸出明显的树枝样突起，常见双核，相邻细胞间形成连接。 1.2足细胞中Nephrin蛋白的定位表达 37℃培养第3d，足细胞中Nephrin蛋白分布于核周及细胞质中；在37℃培养第14d，足细胞中Nephrin蛋白分布于核周及细胞膜。 2.各组足细胞Nephrin的表达 与NG组相比，HG组足细胞中Nephrin蛋白和的mRNA表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 小结：33℃培养的增殖态足细胞，撤IFN-γ后37℃培养14d，足细胞分化成熟；成熟足细胞高糖环境培养48h，可成功建立高糖致损伤模型。 第二部分：丝胶保护高糖致小鼠足细胞损伤的最佳作用浓度 目的： 通过检测足细胞活力，Snai1和miR-30a-5p的表达水平，确定丝胶保护高糖致足细胞损伤的最佳作用浓度。 方法： 1足细胞分组： (1)NG组（正常组：5.5mmol/LD-葡萄糖）； (2)HG组（高糖损伤组：30mmol/LD-葡萄糖）； (3)LS组（低剂量丝胶组：30mmol/LD-葡萄糖+150μg/ml丝胶）； (4)MS组（中剂量丝胶组：30mmol/LD-葡萄糖+300μg/ml丝胶）； (5)HS组（高剂量丝胶组：30mmol/LD-葡萄糖+600μg/ml丝胶）。 2应用倒置显微镜观察足细胞的形态结构。 3应用CCK8法检测足细胞的活力。 4应用Westernblot法检测足细胞Snai1蛋白的表达。 5应用qRT-PCR技术检测足细胞Snai1mRNA和miR-30a-5p的表达。 结果： 1.各组足细胞的形态结构 NG组，足细胞胞体和胞核较大，自胞体伸出明显的树枝样突起，常见双核，相邻细胞间形成连接；HG处理后足细胞形态发生明显改变，细胞皱缩变圆，足突减少融合甚至消失，渐成“梭形细胞样”，且出现漂浮、脱落现象；与HG组相比，LS、MS、HS三组足细胞的形态趋于正常，细胞体积变大，足突较明显，脱落细胞减少。 2.各组足细胞的活力 HG组足细胞活力明显低于NG组(P＜0.05)；LS组、MS组、HS组足细胞活力均明显高于HG组(P＜0.05)；且LS、MS、HS三组足细胞活力两两比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 3.各组足细胞Snai1的表达 与NG组相比，HG组足细胞中Snai1蛋白和mRNA的表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与HG组相比，LS组、MS组、HS组足细胞中Snai1蛋白和mRNA的表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；并且，与LS组、MS组相比，HS组足细胞中Snai1蛋白和mRNA的表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 4.各组足细胞miR-30a-5p的表达 与NG组相比，HG组足细胞中miR-30a-5p的表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与HG组相比，LS组、MS组、HS组足细胞中miR-30a-5p的表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；并且，LS、MS、HS三组足细胞miR-30a-5p的表达两两比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 小结： 1.丝胶对高糖致损伤足细胞具有保护作用。 2.根据三个丝胶组足细胞的活力、Snai1和miR-30a-5p的表达情况，确定丝胶保护高糖致足细胞损伤的最佳作用浓度为600μg/ml。 第三部分：丝胶通过miR-30a-5p靶向Snai1延缓高糖诱导下小鼠足细胞EMT的进程 目的： 以miR-30a-5pinhibitor的最佳浓度转染足细胞，并给予600μg/ml的丝胶干预，综合分析丝胶是否通过调控miR-30a-5p靶向Snai1，延缓高糖刺激下足细胞EMT的进程。 方法： 1将重组质粒和miR-30a-5pmimics/mimicsNC转染进293T细胞，进行双荧光素酶报告基因检测。 2采用0nM、100nM、150nM、200nM的miR-30a-5pinhibitor转染分化成熟的足细胞，通过检测miR-30a-5p和Snai1的表达水平，确定miR-30a-5pinhibitor转染足细胞的最佳浓度。并于倒置荧光倒置显微镜下观察此浓度下被荧光基因标记的足细胞数量，以判断转染效率。 3使用上述确定的miR-30a-5pinhibitor的最佳作用浓度（150nM）转染分化成熟的足细胞4h后换液，同步化处理12h后，不同药物作用48h。细胞分组如下： (1)NG组（正常组：5.5mmol/LD-葡萄糖）； (2)HG组（高糖损伤组：30mmol/LD-葡萄糖）； (3)HS组（丝胶干预组：30mmol/LD-葡萄糖+600μg/ml丝胶）； (4)miR-30a-5pinhibitorNC组（丝胶+30mmol/LD-葡萄糖+miR-30a-5pinhibitornegativecontrol组）； (5)miR-30a-5pinhibitor组（丝胶+30mmol/LD-葡萄糖+miR-30a-5pinhibitor组）。 4应用Transwell实验检测足细胞的迁移能力。 5应用Westernblot法检测足细胞Snai1、podocin、E-cadherin、ZO-1、FSP-1、α-SMA、Desmin蛋白的表达。 6应用qRT-PCR技术检测足细胞Snai1、podocin、E-cadherin、ZO-1、FSP-1、α-SMA、DesminmRNA和miR-30a-5p的表达。 结果： 1.双荧光素酶报告结果显示：与Snai1-3’-UTR-WT+miR-30a-5pmimicsNC组、Snai1-3’-UTR-MU+miR-30a-5pmimics组、Snai1-3’-UTR-MU+miR-30a-5pmimicsNC组、pcmv-neo-Bam+miR-30a-5pmimics组和pcmv-neo-Bam+miR-30a-5pmimicsNC组相比，Snai1-3’-UTR-WT+miR-30a-5pmimics组的荧光素酶活性被显著抑制，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 2.miR-30a-5pinhibitor转染足细胞最佳浓度的确定 与0nM组相比，100nM、150nM组足细胞中miR-30a-5p的表达显著降低，Snai1蛋白的表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；200nM组足细胞中miR-30a-5p和Snai1蛋白的表达无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。与100nM组相比，150nM组足细胞中miR-30a-5p的表达显著降低，Snai1蛋白的表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。因此确定miR-30a-5pinhibitor转染足细胞的最佳浓度是150nM。用150nM的miR-30a-5pinhibitor转染足细胞4h后，倒置荧光显微镜下观察并计数，转染效率约为85%。 3.各组足细胞的迁移数量 Transwell实验结果显示，HG组Transwell下室足细胞数量明显高于NG组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HS组Transwell下室足细胞数量明显低于HG组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；miR-30a-5pinhibitor组Transwell下室足细胞数量明显高于HS组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 4.各组足细胞Snai1、上皮表型相关因子podocin、E-cadherin、ZO-1以及间质表型相关因子FSP-1、α-SMA、Desmin的表达情况 4.1各组足细胞Snai1的表达 HG组足细胞中Snai1蛋白和mRNA的表达明显高于NG组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HS组足细胞中Snai1蛋白和mRNA的表达明显低于HG组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；miR-30a-5pinhibitor组足细胞中Snai1蛋白和mRNA的表达明显高于HS组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 4.2各组足细胞podocin、E-cadherin、ZO-1的表达 HG组足细胞中podocin、E-cadherin、ZO-1蛋白和mRNA的表达明显低于NG组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HS组足细胞中podocin、E-cadherin、ZO-1蛋白和mRNA的表达明显高于HG组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；miR-30a-5pinhibitor组足细胞中podocin、E-cadherin、ZO-1蛋白和mRNA的表达明显低于HS组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 4.3各组足细胞FSP-1、α-SMA、Desmin的表达 HG组足细胞中FSP-1、α-SMA、Desmin蛋白和mRNA的表达明显高于NG组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HS组足细胞中FSP-1、α-SMA、Desmin蛋白和mRNA的表达明显低于HG组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；miR-30a-5pinhibitor组足细胞中FSP-1、α-SMA、Desmin蛋白和mRNA的表达明显高于HS组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 小结： 1.Snai1是miR-30a-5p的靶基因之一，miR-30a-5p可抑制Snai1的表达。 2.丝胶可通过miR-30a-5p靶向抑制Snai1，上调podocin、E-cadherin、ZO-1的表达，下调FSP-1、α-SMA、Desmin，影响高糖刺激下足细胞的EMT进程并降低足细胞的迁移率。 结论： 1.高糖作用分化成熟的足细胞48h，可成功建立高糖致损伤足细胞模型；丝胶保护高糖致足细胞损伤的最佳作用浓度是600μg/ml。 2.Snai1是miR-30a-5p的靶基因之一，miR-30a-5p可抑制Snai1的表达。 3.丝胶可通过miR-30a-5p靶向抑制Snai1，上调上皮表型相关因子的表达、下调间质表型相关因子的表达，影响足细胞的EMT进程并降低足细胞的迁移率，从而对高糖致损伤足细胞发挥保护作用。
丝胶;糖尿病肾病;上皮间质转分化;miR-30a-5p;足细胞
承德医学院
硕士
人体解剖与组织胚胎学
宋成军;陈志宏
2021
中文
R587.2;R692.9
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）