Ras-ERK-CREB信号通路介导SSF促进神经发生和改善记忆障碍的分子机制研究
阿尔茨海默病(Alzheimer''sdisease,AD)患者临床表现损害其独立的生活能力。那么镜下观察AD患者神经病理学表征为老年斑和神经纤维缠结，同时神经元的丢失等。神经元的丢失是AD行为异常和智能损害等临床表现的直接原因之一。然而，多条信号通路参与调节神经发生，可产生新的有功能的神经元来补偿AD中神经元的丢失，改善AD神经结构和认知功能障碍，进而发挥抗AD的作用。研究表明，AD的发生与发展和多条传递异常的信号通路有关，其中Ras-ERK-CREB信号通路已证实对神经元具有重要的调节作用，并且在日常行为和学习、记忆等方面等有重要改善作用。 黄芩茎叶黄酮(ScutellariabaicalensisGeorgistemsandleavesflavonoids,SSF)前期研究证实，SSF具有抗病毒和提高学习记忆能力等药理学活性，但SSF对脑室微量注射Aβ25-35结合AlCl3和RHTGF-β1(复合Aβ)建立的AD记忆障碍大鼠模型是否通过Ras-ERK-CREB信号转导通路促进神经发生的机制至今未见报道。本课题脑室微量注射Aβ25-35结合AlCl3和RHTGF-β1建立AD模型，通过对复合Aβ模型大鼠学习记忆功能、神经发生相关蛋白Ki67和Ras-ERK-CREB信号通路中重要蛋白分子的检测，确定SSF具有改善其学习记忆障碍和促进神经发生的作用，阐明通过Ras-ERK-CREB信号通路来促进神经发生的分子机制研究。 目的： 利用大鼠脑室微量注射复合Aβ建立AD记忆障碍以及神经损伤模型，观察Ras-ERK-CREB信号通路介导黄芩茎叶黄酮(SSF)对其记忆障碍和神经发生的影响以及调节机制。 方法： SPF级雄性Wistar大鼠70只，体重280-300g，手术前安置在屏障环境内适应性饲养7天。60只大鼠脑室微量注射复合Aβ，手术第1天脑室微量注射1μL的RHTGF-β1(10ng)，手术第2-15天，分别与每日向脑室微量注射14天1μL的Aβ25-35，5天3μL的AlCl3。另设同期10只大鼠做相同手术，脑室微量注射等体积的0.9%NaCl，作为假手术组。Morris水迷宫筛选模型成功大鼠，根据水迷宫第4天潜伏期的成绩作为筛选率(SR)。随机将大鼠中AD成功模型分为模型组和SSF三个剂量组，灌胃41天。Morris水迷宫和跳台检测学习记忆能力。所有大鼠在术后第89天，断头取材。免疫组化法(IHC)检测大鼠脑内与神经发生相关分子Ki67蛋白的表达。实时定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印迹法(WB)检测大鼠海马、皮层在Ras-ERK-CREB信号通路中BDNF、Grb2、SOS1、Ras、c-Raf、P-ERK1/2、P-MEKs和Rsk的mRNA和蛋白表达的水平。 结果： 1.Morris水迷宫筛选AD模型成功大鼠 所有大鼠1-4天在水迷宫内找到隐藏平台的潜伏期都逐渐缩短，且假手术组找到隐藏平台潜伏期比脑室注射复合Aβ组明显降低，本实验AD模型成功率是83.30%。 2.Morris水迷宫检测SSF对复合Aβ大鼠空间学习记忆能力的影响 在水迷宫1-2天的定位航行和水迷宫4-6天的对侧实验中，模型组潜伏期比假手术组延长(Plt;0.01)，SSF剂量组大鼠找到的潜伏期比模型组明显缩短(Plt;0.01)。在水迷宫的第3天实验中，模型组在第Ⅳ象限的游泳总时长、穿越平台次数比假手术组大鼠减少(Plt;0.01)，SSF组大鼠在第Ⅳ象限的游泳总时长、穿越平台次数均不同程度的增加(Plt;0.01)。 3.跳台检测SSF对复合Aβ大鼠被动回避性学习记忆的影响 在跳台箱1-2天的被动回避性实验中，与假手术组比较，模型组错误次数显著增加(Plt;0.01)，然而，潜伏期缩短(Plt;0.01)。与模型组比较，SSF三个剂量组大鼠错误次数显著减少(Plt;0.01)，潜伏期明显延长(Plt;0.01)。 4.SSF对复合Aβ大鼠海马齿状回中Ki67蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组海马齿状回神经细胞数量明显减少(Plt;0.01)。与模型组比较，SSF35、70和140mg/kg三个剂量组不同程度逆转海马齿状回神经细胞Ki67蛋白表达降低(Plt;0.01)，棕黄色颗粒颜色逐渐加深。 5.SSF对复合Aβ大鼠海马、皮层中BDNF、Grb2、SOS1、Ras、c-Raf、P-MEKs、P-ERK1/2和RSK的mRNA、蛋白表达的影响 qPCR和Westernblotting检测模型组大鼠脑内BDNF、Grb2、SOS1、Ras、c-Raf、ERK1/2(P-ERK1/2)、MEKs(P-MEKs)和Rsk的mRNA和蛋白均不同程度比假手术组升高(Plt;0.01)。然而，SSF明显逆转其在复合Aβ所致大鼠脑内的异常表达。SSF35、70和140mg/kg三个剂量组比模型组海马和皮层中BDNF、Grb2、SOS1、Ras、c-Raf、ERK1/2(P-ERK1/2)、MEKs(P-MEKs)和Rsk的mRNA和蛋白的表达水平均不同程度降低(Plt;0.01)。 结论： 大鼠脑室微量注射Aβ25-35结合AlCl3和RHTGF-β1能够引起学习记忆障碍、神经发生减少以及Ras-ERK-CREB信号通路中因子的在脑内异常表达。而SSF干预后，可以促进复合Aβ模型大鼠的神经发生，改善复合Aβ所致大鼠的学习记忆障碍，作用机制可能与Ras-ERK-CREB信号通路在海马和皮层组织中BDNF、Grb2、SOS1、Ras、c-Raf、P-ERK1/2、P-MEKs和Rsk的mRNA和蛋白的表达水平有关，阐明了Ras-ERK-CREB信号通路介导SSF促进神经发生和改善记忆障碍的分子机制。
阿尔茨海默病;黄芩茎叶黄酮;学习记忆;神经发生;Ras-ERK-CREB信号通路
承德医学院
硕士
中药学
商亚珍
2021
中文
R285;R749.16
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）