RFRP-3对OEP大鼠下丘脑差异蛋白分析及对人乳腺癌MCF-7细胞系抑制作用的研究
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，与肺癌和结肠癌并列为全球三大常见癌症之一。研究发现雌激素水平的升高与乳腺癌的发生发展密切相关，其原因可能与下丘脑释放GnRH，刺激FSH和LH的分泌有关。FSH可刺激卵巢卵泡中雌激素的合成，然后作用于下丘脑以诱导LH的产生。LH的急剧升高会触发排卵和黄体发育。绝经后，卵巢产生的雌激素水平可忽略不计。初潮提前和绝经期滞后与乳腺癌的高发风险有关，这突出了性腺激素生成在正常乳腺发育和乳腺癌中的重要性。本课题组前期研究显示，卵巢摘除术补充雌激素（OEP）大鼠侧脑室微量注射RFRP-3后，可影响GnRH、LH、FSH等激素的释放，但对激素依赖性肿瘤研究较少。促性腺激素对卵巢中雌激素、孕激素等性激素的释放具有调节作用，因此本课题假设侧脑室微量注射RFRP-3后可影响OEP大鼠下丘脑蛋白质的分泌，而下丘脑蛋白质的变化可能影响GnRH的分泌，进一步调节垂体促性腺激素的释放，从而影响下游靶器官的生理或病理变化。本实验通过蛋白质组学结合生物信息学的方法探讨侧脑室微量注射RFRP-3后OEP大鼠下丘脑蛋白质表达的变化，发现差异蛋白主要参与糖酵解等途径。已知糖酵解可以刺激GnRH的释放，故推测糖酵解途径可能是GnIH抑制GnRH释放的机制之一，GnRH可以调节雌激素、孕激素等性腺激素的释放，而雌激素的异常与乳腺癌的发生发展相关。因此本实验假设RFRP-3可能通过此通路调节激素依赖性乳腺癌的发生发展。为验证此假设，本实验用RFRP-3处理人乳腺癌细胞系MCF-7结果显示10000ng/ml的RFRP-3可能通过阻碍PI3K/AKT/mTOR/HIF-1通路抑制糖酵解诱导人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡。 第一部分 基于蛋白质组学研究侧脑室微量注射RFRP-3对OEP大鼠下丘脑蛋白质的调节 目的： 通过蛋白质组学与生物信息学探索侧脑室微量注射RFRP-3对下丘脑蛋白质调节情况。 方法： 1、选取30只成年雌性SD大鼠，构建卵巢摘除术补充雌激素（OEP）大鼠模型，随机分为注射RFRP-3实验组和生理盐水对照组，根据《The Rat Brain in stereotaxic coordinates》确定大鼠侧脑室位置，分别注射RFRP-3和生理盐水（16μl/kg，RFRP-3浓度为2μg/μl），每30秒注射0.5μl，于4min完成注射。给药6h后取出下丘脑，制备蛋白样品。 2、下丘脑蛋白样品酶解，经戴安Dionex ultimate3000nano LC system纳升级液相色谱系统进行LC-MS/MS分析。用Maxquant-1.5.2.0算法对肽段进行非标记蛋白质组学定量分析，得到质谱检测的原始数据。 3、对质谱原始数据进行GO基因本体分析、KEGG信号通路富集分析和蛋白-蛋白互作分析，筛选差异表达蛋白质和信号通路。 4、通过CPTAC和HPA数据库鉴定节点蛋白在肿瘤中的表达及生存分析。 结果： 1、下丘脑差异蛋白的质谱结果由Uniprot Mouse数据库检索并匹配，共鉴定出253个差异表达蛋白，其中129个蛋白上调，124个蛋白下调。 2、GO结果显示，差异蛋白的生物过程（BP）主要在单一生物体和小分子代谢过程中存在富集，细胞成分（Cell Component，CC）差异蛋白主要在细胞质和胞核富集，分子功能（MF）主要体现在与小分子结合的功能上。 3、KEGG结果显示，差异蛋白主要参与糖酵解、代谢途径、内分泌等10条重要信号通路（P＜0.05）。 4、OmicsBean软件可视化蛋白互作网络图（PPI）分析显示：节点蛋白GALM、ADPGK、PGM1、PFKL为上调，ALDH2为下调蛋白（FC≥2）。 5、CPTAC和HPA数据库结果提示节点蛋白GALM（P=0.050）、ADPGK（P=0.0060）、PGM1（P=0.25）、PFKL（P=0.0062）和ALDH2（P=0.0092）在乳腺癌组织及癌旁组织中差异表达及生存分析。 第二部分 RFRP-3通过PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α通路抑制糖酵解途径诱导人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡的研究 目的： 探讨RFRP-3对人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡的影响及作用机制。 方法： 1、体外培养人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468，设空白调零组、PBS对照组和RFRP-3实验组（0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml），CCK-8法确定最佳作用时间和浓度。 2、流式细胞术检测人乳腺癌细胞系MCF-7经RFRP-3处理后的凋亡率。 3、利用蛋白印迹法（Western Blot），检测RFRP-3在最佳浓度10μg/ml时人乳腺癌细胞系MCF-7的ADPGK、Bcl-2、Bax、cytochrome C、Caspase-3、P53、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR、HIF-1α和G蛋白偶联受体GPR147的蛋白表达情况。 4、使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR），检测RFRP-3在最佳浓度时人乳腺癌细胞系MCF-7的Bcl-2、Bax、cytochrome C、Caspase-3、P53、PI3K和AKT的mRNA表达情况。 结果： 1、各浓度组RFRP-3对人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞作用情况。 人乳腺癌细胞系MCF-7常规培养，设空白调零组、对照组和RFRP-3实验组（0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml）加入RFRP-3作用24h和48h。组间比较，当RFRP-3作用时间为24h时，药物浓度达到10μg/ml时对MCF-7细胞增殖显著抑制，差异有统计学意义（P＜0.05）。各浓度组RFRP-3对细胞系MDA-MB-453和MDA-MB-468均无影响（P＞0.05）。 2、对照组与RFRP-3（10μg/ml）实验组细胞凋亡情况。 流式细胞仪检测结果：对照组和RFRP-3（10μg/ml）时的细胞凋亡率分别为（7.76±1.57）%、（16.14±3.001）%。对照组与RFRP-3（10μg/ml）实验组比较细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。 3、RFRP-3上调MCF-7细胞ADPGK、Bax、Caspase-3、cytochrome C、P53蛋白的表达水平。 MCF-7细胞中加入RFRP-3后，与对照组相比，RFRP-3（10μg/ml）实验组Bax（P＜0.01）、Caspase-3（P＜0.01）、cytochrome C（P＜0.01）和P53（P＜0.05）及关键蛋白ADPGK（P＜0.01）表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。 4、RFRP-3下调MCF-7细胞Bcl-2、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR、HIF-1α蛋白的表达水平。 MCF-7细胞中加入RFRP-3后，对照组和RFRP-3（10μg/ml）实验组组间比较Bcl-2（P＜0.05）、PI3K（P＜0.05）、AKT/p-AKT（P＜0.01）、mTOR（P＜0.05）、HIF-1α（P＜0.05）蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义。 5、RFRP-3上调MCF-7细胞Bax、Caspase-3、P53mRNA的表达水平。 在MCF-7细胞中加入RFRP-3后，10μg/ml实验组与对照组相比Bax mRNA表达水平上调（P＜0.05）、Caspase-3mRNA表达水平上调（P＜0.01）和TP53mRNA表达水平显著上调（P＜0.05）。 6、RFRP-3下调MCF-7细胞Bcl-2、PI3K与AKT的mRNA表达水平。 在MCF-7细胞中加入RFRP-3后，10μg/ml实验组与对照组相比Bcl-2mRNA表达水平显著下调（P＜0.01）、PI3K mRNA表达水平显著下调（P＜0.05）与AKT mRNA表达水平显著下调（P＜0.05）。 结论： 1、侧脑室微量注射RFRP-3，结果显示差异蛋白主要参与糖酵解途径，其中GALM、ALDH2、ADPGK、PGM1、PFKL为节点蛋白。 2、RFRP-3可能通过GPR147受体诱导乳腺癌细胞MCF-7的凋亡，其凋亡机制可能与阻碍PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α通路抑制糖酵解有关。
乳腺癌;促性腺激素抑制激素;RFRP神经肽;下丘脑;蛋白质调节;糖酵解;细胞凋亡
承德医学院
硕士
人体解剖与组织胚胎学
乔跃兵
2021
中文
R737.9
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）