RFRP-3对OEP大鼠下丘脑差异蛋白分析及对人乳腺癌MCF-7细胞系抑制作用的研究
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,与肺癌和结肠癌并列为全球三大常见癌症之一。研究发现雌激素水平的升高与乳腺癌的发生发展密切相关,其原因可能与下丘脑释放GnRH,刺激FSH和LH的分泌有关。FSH可刺激卵巢卵泡中雌激素的合成,然后作用于下丘脑以诱导LH的产生。LH的急剧升高会触发排卵和黄体发育。绝经后,卵巢产生的雌激素水平可忽略不计。初潮提前和绝经期滞后与乳腺癌的高发风险有关,这突出了性腺激素生成在正常乳腺发育和乳腺癌中的重要性。本课题组前期研究显示,卵巢摘除术补充雌激素(OEP)大鼠侧脑室微量注射RFRP-3后,可影响GnRH、LH、FSH等激素的释放,但对激素依赖性肿瘤研究较少。促性腺激素对卵巢中雌激素、孕激素等性激素的释放具有调节作用,因此本课题假设侧脑室微量注射RFRP-3后可影响OEP大鼠下丘脑蛋白质的分泌,而下丘脑蛋白质的变化可能影响GnRH的分泌,进一步调节垂体促性腺激素的释放,从而影响下游靶器官的生理或病理变化。本实验通过蛋白质组学结合生物信息学的方法探讨侧脑室微量注射RFRP-3后OEP大鼠下丘脑蛋白质表达的变化,发现差异蛋白主要参与糖酵解等途径。已知糖酵解可以刺激GnRH的释放,故推测糖酵解途径可能是GnIH抑制GnRH释放的机制之一,GnRH可以调节雌激素、孕激素等性腺激素的释放,而雌激素的异常与乳腺癌的发生发展相关。因此本实验假设RFRP-3可能通过此通路调节激素依赖性乳腺癌的发生发展。为验证此假设,本实验用RFRP-3处理人乳腺癌细胞系MCF-7结果显示10000ng/ml的RFRP-3可能通过阻碍PI3K/AKT/mTOR/HIF-1通路抑制糖酵解诱导人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡。 第一部分 基于蛋白质组学研究侧脑室微量注射RFRP-3对OEP大鼠下丘脑蛋白质的调节 目的: 通过蛋白质组学与生物信息学探索侧脑室微量注射RFRP-3对下丘脑蛋白质调节情况。 方法: 1、选取30只成年雌性SD大鼠,构建卵巢摘除术补充雌激素(OEP)大鼠模型,随机分为注射RFRP-3实验组和生理盐水对照组,根据《The Rat Brain in stereotaxic coordinates》确定大鼠侧脑室位置,分别注射RFRP-3和生理盐水(16μl/kg,RFRP-3浓度为2μg/μl),每30秒注射0.5μl,于4min完成注射。给药6h后取出下丘脑,制备蛋白样品。 2、下丘脑蛋白样品酶解,经戴安Dionex ultimate3000nano LC system纳升级液相色谱系统进行LC-MS/MS分析。用Maxquant-1.5.2.0算法对肽段进行非标记蛋白质组学定量分析,得到质谱检测的原始数据。 3、对质谱原始数据进行GO基因本体分析、KEGG信号通路富集分析和蛋白-蛋白互作分析,筛选差异表达蛋白质和信号通路。 4、通过CPTAC和HPA数据库鉴定节点蛋白在肿瘤中的表达及生存分析。 结果: 1、下丘脑差异蛋白的质谱结果由Uniprot Mouse数据库检索并匹配,共鉴定出253个差异表达蛋白,其中129个蛋白上调,124个蛋白下调。 2、GO结果显示,差异蛋白的生物过程(BP)主要在单一生物体和小分子代谢过程中存在富集,细胞成分(Cell Component,CC)差异蛋白主要在细胞质和胞核富集,分子功能(MF)主要体现在与小分子结合的功能上。 3、KEGG结果显示,差异蛋白主要参与糖酵解、代谢途径、内分泌等10条重要信号通路(P<0.05)。 4、OmicsBean软件可视化蛋白互作网络图(PPI)分析显示:节点蛋白GALM、ADPGK、PGM1、PFKL为上调,ALDH2为下调蛋白(FC≥2)。 5、CPTAC和HPA数据库结果提示节点蛋白GALM(P=0.050)、ADPGK(P=0.0060)、PGM1(P=0.25)、PFKL(P=0.0062)和ALDH2(P=0.0092)在乳腺癌组织及癌旁组织中差异表达及生存分析。 第二部分 RFRP-3通过PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α通路抑制糖酵解途径诱导人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡的研究 目的: 探讨RFRP-3对人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡的影响及作用机制。 方法: 1、体外培养人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468,设空白调零组、PBS对照组和RFRP-3实验组(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml),CCK-8法确定最佳作用时间和浓度。 2、流式细胞术检测人乳腺癌细胞系MCF-7经RFRP-3处理后的凋亡率。 3、利用蛋白印迹法(Western Blot),检测RFRP-3在最佳浓度10μg/ml时人乳腺癌细胞系MCF-7的ADPGK、Bcl-2、Bax、cytochrome C、Caspase-3、P53、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR、HIF-1α和G蛋白偶联受体GPR147的蛋白表达情况。 4、使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR),检测RFRP-3在最佳浓度时人乳腺癌细胞系MCF-7的Bcl-2、Bax、cytochrome C、Caspase-3、P53、PI3K和AKT的mRNA表达情况。 结果: 1、各浓度组RFRP-3对人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞作用情况。 人乳腺癌细胞系MCF-7常规培养,设空白调零组、对照组和RFRP-3实验组(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml)加入RFRP-3作用24h和48h。组间比较,当RFRP-3作用时间为24h时,药物浓度达到10μg/ml时对MCF-7细胞增殖显著抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。各浓度组RFRP-3对细胞系MDA-MB-453和MDA-MB-468均无影响(P>0.05)。 2、对照组与RFRP-3(10μg/ml)实验组细胞凋亡情况。 流式细胞仪检测结果:对照组和RFRP-3(10μg/ml)时的细胞凋亡率分别为(7.76±1.57)%、(16.14±3.001)%。对照组与RFRP-3(10μg/ml)实验组比较细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。 3、RFRP-3上调MCF-7细胞ADPGK、Bax、Caspase-3、cytochrome C、P53蛋白的表达水平。 MCF-7细胞中加入RFRP-3后,与对照组相比,RFRP-3(10μg/ml)实验组Bax(P<0.01)、Caspase-3(P<0.01)、cytochrome C(P<0.01)和P53(P<0.05)及关键蛋白ADPGK(P<0.01)表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。 4、RFRP-3下调MCF-7细胞Bcl-2、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR、HIF-1α蛋白的表达水平。 MCF-7细胞中加入RFRP-3后,对照组和RFRP-3(10μg/ml)实验组组间比较Bcl-2(P<0.05)、PI3K(P<0.05)、AKT/p-AKT(P<0.01)、mTOR(P<0.05)、HIF-1α(P<0.05)蛋白表达水平显著下降,差异有统计学意义。 5、RFRP-3上调MCF-7细胞Bax、Caspase-3、P53mRNA的表达水平。 在MCF-7细胞中加入RFRP-3后,10μg/ml实验组与对照组相比Bax mRNA表达水平上调(P<0.05)、Caspase-3mRNA表达水平上调(P<0.01)和TP53mRNA表达水平显著上调(P<0.05)。 6、RFRP-3下调MCF-7细胞Bcl-2、PI3K与AKT的mRNA表达水平。 在MCF-7细胞中加入RFRP-3后,10μg/ml实验组与对照组相比Bcl-2mRNA表达水平显著下调(P<0.01)、PI3K mRNA表达水平显著下调(P<0.05)与AKT mRNA表达水平显著下调(P<0.05)。 结论: 1、侧脑室微量注射RFRP-3,结果显示差异蛋白主要参与糖酵解途径,其中GALM、ALDH2、ADPGK、PGM1、PFKL为节点蛋白。 2、RFRP-3可能通过GPR147受体诱导乳腺癌细胞MCF-7的凋亡,其凋亡机制可能与阻碍PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α通路抑制糖酵解有关。
乳腺癌;促性腺激素抑制激素;RFRP神经肽;下丘脑;蛋白质调节;糖酵解;细胞凋亡
承德医学院
硕士
人体解剖与组织胚胎学
乔跃兵
2021
中文
R737.9
2021-11-17(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)