AcrVA5介导的乙酰化和CobB介导的去乙酰化修饰对Cas12a切割活力的可逆调控研究
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）系统是一种被细菌用来抵御外来噬菌体入侵的获得性免疫机制。Cas12a蛋白通过CRISPR RNA（crRNA）引导特异性靶向入侵的外源基因片段，并切割该片段，从而使细菌不被侵染。由于具备可编程性，和Cas9一样，Cas12a也被开发为多个物种的基因编辑工具。为了降低基因编辑的脱靶率，人们开发了包括anti-CRISPR蛋白在内的多种方法来精准调控Cas蛋白的作用强度和作用时间，以期开发出更安全、更高效、更精确的基因编辑工具。其中，AcrVA5作为乙酰基转移酶便是anti-Cas12a的蛋白，可乙酰化Cas12a蛋白并使其失活。 本课题在AcrVA5可乙酰化修饰失活Cas12a的基础上，进一步证明了AcrVA5的乙酰化修饰受体具有广泛性，并可乙酰化失活多种Cas12a蛋白。通过体外纯化AcrVA5和五种Cas12a蛋白，进行体外乙酰化实验和Cas蛋白的顺式与反式切割实验，证明了AcrVA5能乙酰化修饰降低LbCas12a、Mb2Cas12a、AsCas12a、FnCas12a、Lb5Cas12a蛋白对靶双链DNA的顺式和反式切割活性。此外，还证明了AcrVA5具有广谱乙酰基转移酶活性，且CobB蛋白能去乙酰化修饰大部分被AcrVA5失活的蛋白，如LbCas12a、Mb2Cas12a、AsCas12a和FnCas12a，并恢复其顺式和反式切割活性。然而，CobB蛋白不能恢复被AcrVA5失活的Lb5Cas12a，其机制有待探寻。 之前研究报道AcrVA5通过乙酰化修饰LbCas12a的Lys613位点，使其乙酰化后并失去识别PAM位点的能力。然而，本课题发现LbCas12a的Lys613突变为精氨酸后仍然能够被AcrVA5介导的乙酰化修饰失活，因此推测PAM序列区含有不止一个关键氨基酸位点参与了Cas蛋白对靶标DNA的识别。 本课题通过对AcrVA5和CobB蛋白可逆修饰Cas12a的研究，加深了对CRISPR和anti-CRISPR作用机制以及细菌和噬菌体共进化机制的理解，并有助于将来开发更好的基因编辑工具。
细菌免疫;CRISPR系统;Cas12a蛋白;乙酰化;去乙酰化;切割活力;可逆调控
上海师范大学
硕士
微生物学
王金
2021
中文
Q939.1
2021-11-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）