流式细胞术在微生物检测中应用研究
食品质量安全不仅与微生物的种类有关，而且与微生物的数量密切相关。长期以来，食品微生物的检测以培养法为金标准，虽然灵敏度符合市场需求，但也存在结果不全面、实验时间长、操作要求高等局限性。本课题利用流式细胞术，建立了水中微生物的检测方法，构建了CytoMICRO试剂盒，搭建了乳制品中微生物快速检测云平台，开展了方法、试剂盒与系统在乳及乳制品实际样品微生物检测的应用研究。 饮用水安全对于我们生活与生产至关重要，世界上每3人有1人无法获得安全饮水，水中微生物的快速检测方法成为研究的热点。本文以流式细胞术为方法，水中微生物为对象，建立了基于流式细胞术的水中微生物的快速检测方法。利用人工污染样结果表明：荧光染料SYTO?9最佳添加量为5μL，荧光染料PI最佳添加量5μL，36±1℃下最佳染色孵育时间为10min，进样速度为30μL/min，上机检测时间为60s。人工污染样微生物浓度在103cell/mL~106cell/mL范围内，相对标准偏差小于5%，具有良好的重复性。由于水样中微生物浓度较低，需要进行前处理，研究中采用滤膜富集方法，实验结果表明：富集滤膜材质为水系MCE膜，滤膜孔径为0.22μm，样品富集量为1000mL，最终检测结果的回收率为86.67%。利用该方法对学校某大楼的自来水进行实样检测，结果表明：微生物总数为1.65×105cell/mL~2.04×105cell/mL，活性细菌数量约为2.61×103cell/mL~4.00×103cell/mL，同时开展的以GB/T5750.12-2006平板计数法，得水中菌落总数lt;100CFU/mL。两种方法的结果存在差异，分析表明，可能原因是，自来水中营养物质匮乏，微生物处于亚致死或休眠状态，现行国标方法仅能培养好氧微生物，而流式细胞术能对样品中所有的生物性颗粒物进行直接计数，因此，通过流式细胞术获得的微生物数远大于国标法微生物计数结果。 本文构建了基于流式细胞术的CytoMICRO试剂盒，制定了CytoMICRO--发酵乳中乳酸菌计数操作规范。以ISO16140和SN/T2775-2011为评价依据，GB4789.35-2016为参比方法对试剂盒进行了效能评价与优化。结果表明：本试剂盒方法的最低检测限为103cell/mL；在设置的三种温度下检测结果显著性水平Pgt;0.05，耐变性良好；对于检测的样品，靶标微生物的终浓度控制在103-107cell/mL，重现性为RSD小于10%；本试剂盒在0-4℃避光下可保存10周。利用试剂盒对市售21份发酵乳产品进行检测，采用流式细胞术的检测方法的结果与GB4789.35-2016平板计数法结果相关性P=0.9318。 实践中，流式细胞术在微生物检验中的推广仍存在不少难题，如流式细胞仪较昂贵，结果分析需要较多的经验积累等。课题组开发了乳制品中微生物快速检测云平台，用户登录APP，在手机端与中央实验室的PC端实现数据的传递，按要求递送样品，通过在中央实验室部署的流式细胞仪，对样品进行检测，对数据进行分析，结果通过云端传递，搭建了采样-送样-检测-分析闭环架构。可解决方法仪器单价高，结果解读困难的问题，有助于流式细胞术微生物检测技术的推广。
食品安全;微生物检测;流式细胞术;试剂盒
上海师范大学
硕士
微生物学
赵渝
2021
中文
TS207.4
2021-11-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）