蓝藻NdhO与Fd互作的氨基酸位点鉴定及功能分析
光合NDH-1位于类囊体膜上，参与围绕光系统I环式电子传递（cyclicelectrontransferaroundphotosystemI;PSICET）等生化反应。在蓝藻NDH-1介导的PSICET（NDH-CET）是一种重要的抗氧化机制。在环境胁迫条件下，NDH-CET可以产生额外的ATP，优化ATP/NADPH比例，促进碳同化和减少活性氧（reactiveoxygenspeicies;ROS）生产，从而提高光合效率。近来，我们实验室的结构与功能数据指出：调控亚基NdhO与NDH-1电子供体铁氧还蛋白（ferredoxin;Fd）存在互作，它的缺失增加NDH-CET活性。然而，人们对NdhO负调控PSICET活性的机制尚了解不够。因此，本论文通过对NdhO与Fd互作的关键位点进行突变并进行了功能分析，确定了这一亚基和Fd互作的氨基酸位点。主要研究结果简述如下： （1）为了寻找集胞藻6803（Synechocysitssp.strainPCC6803）中NDH-1复合体亚基NdhO中可能和Fd发生互作的氨基酸位点，通过生物信息学等手段，我们发现NDH-1复合体NdhO亚基在集胞藻6803和热藻中是高度保守的。通过表面静电荷结构作图分析发现，蓝藻NdhO亚基表面为正电位，且其表面存在两个带正电荷的赖氨酸。 （2）为了确定NdhO亚基中的两个赖氨酸是否和Fd存在相互作用，我们构建了NdhO亚基两个赖氨酸点突变的酵母表达载体。利用酵母双杂交等技术，我们发现蓝藻NdhO亚基上两个带正电荷的赖氨酸（K6和K7）突变成带负电荷的天冬氨酸（E6和E7）后，NdhO与Fd没有相互作用。这一结果建议这两个赖氨酸氨基酸是NdhO亚基与Fd互作的关键位点。 （3）为了确定和Fd存在相互作用的两个氨基酸位点是否影响NDH-1的功能，我们构建了NdhO亚基这两个氨基酸的点突变株，包括两个单点突变株ndhOΔK6E、ndhOΔK7E和一个双点突变株ndhOΔK/E。测序结果表明在蓝藻中NdhO这两个赖氨酸已正确点突变成天冬氨酸。 （4）为了进一步研究蓝藻NdhO亚基上的两个氨基酸突变后是否影响NDH-1的功能，通过叶绿素调制荧光等手段，我们对ndhOΔK6E、ndhOΔK7E和点突变ndhOΔK/E突变体中的NDH-CET活性进行了检测。正如预期，在生长光和短时高光诱导条件下，与野生型相比，ndhOΔK6E、ndhOΔK7E和ndhOΔK/E突变体中NDH-CET活性得到了增强。这一结果表明蓝藻NdhO上的两个赖氨酸突变后影响了NDH-1的功能。 综上所述，通过分子、生化和生理等手段，本论文发现Fd与NdhO亚基间的电荷相互作用，NdhO上两个带正电荷的赖氨酸点突变成带负电荷的天冬氨酸后增强了NDH-CET活性，从而确定了蓝藻NdhO与Fd互作的关键氨基酸位点。因此，本研究结果为人们阐明NdhO负调控PSICET活性机制奠定了基础。
蓝藻;NDH-CET;NDH-1复合体;环式电子传递;活性氧
上海师范大学
硕士
植物学
马为民
2021
中文
Q943.2
2021-11-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）