鸡滑液囊支原体NADH氧化酶单克隆抗体的制备与鉴定
滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)是引起禽类呼吸道疾病的主要病原体，鸡或火鸡感染MS会引起气囊炎、关节渗出性滑膜炎，发病鸡出现跛行、产蛋减少和体制下降的现象，可垂直传播给后代，给全世界养禽业造成巨大的经济损失。MS感染大多数情况下呈区域性的发病，很少发生大规模的爆发。近几年，由于我国对MS防控相对鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum，MG)较薄弱，导致MS感染越发严重。 NADH氧化酶(NADH oxidase, NOX)是一种氧化还原酶，是维持生物代谢生长的重要酶类。有研究表明NOX不仅具有酶的催化作用，在某些致病菌中还是膜表面黏附相关因子，能协助病原菌黏附宿主细胞，甚至影响毒力。本实验室前期研究表明MS的NOX不仅在胞浆中发挥催化酶的功能，在MS的膜表面也有少量存在，且具有免疫原性，是可能的黏附相关蛋白。 本研究用本实验室前期构建好的重组菌株E.coliBL21(pET28a-MSNOX)，通过IPTG诱导表达后，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)分析重组MSNOX(recombinant MSNOX，rMSNOX)蛋白于上清和沉淀中均表达，用His-Tag磁珠纯化上清中的rMSNOX蛋白，得到较为纯净的rMSNOX蛋白。用纯化后的rMSNOX蛋白与弗氏佐剂同体积混合乳化，对BALB/c小鼠进行免疫，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠效价，将效价最高小鼠的脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞融合。通过间接ELISA和有限稀释法对融合的杂交瘤细胞进行筛选，直至筛选出能够稳定分泌抗rMSNOX蛋白抗体的杂交瘤细胞株。采用间接ELISA和免疫印迹法(Western blot)对单克隆抗体进行特异性的检测，将获得的杂交瘤细胞连续传代10次和反复冻融，测试杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。 本研究成功制备了一株能够稳定分泌抗rMSNOX蛋白抗体的杂交瘤细胞株，命名为2F4，经间接ELISA、Westernblot、悬浮免疫荧光结果显示，该单克隆抗体均可与滑液囊支原体发生特异性反应，并且与其他禽类致病菌不发生反应。通过单克隆抗体亚型分析试剂盒，鉴定该单克隆抗体为IgG2b亚类，κ链；通过连续传代，反复冻融，仍然具有稳定分泌抗体的能力，表明该单克隆抗体具有很好的稳定性；通过秋水仙素法对杂交瘤细胞株进行染色体分析，该株杂交瘤细胞2F4有98±5条染色体，符合杂交瘤细胞染色体的数目；将杂交瘤细胞经腹腔注射至6-8周龄BALB/c小鼠中制备腹水，经间接ELISA检测腹水效价达到1:2048000。 综上所述，本研究成功表达和纯化了rMSNOX蛋白，且成功制备了1株能够稳定分泌抗rMSNOX蛋白抗体的杂交瘤细胞株，为建立滑液囊支原体的检测方法及进一步研究MSNOX在MS致病机制中的作用奠定了基础。
滑液囊支原体;NADH氧化酶;单克隆抗体;ELISA;rMSNOX蛋白
山东农业大学
硕士
兽医
蔡玉梅
2021
中文
S852.62
2021-09-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）