HDACi丙戊酸联合电离辐射对乳腺癌细胞的增殖抑制作用及其机制研究
研究背景： 乳腺癌(Breast Cancer, BC)是最常见的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。由于乳腺癌靶向药物的耐药性以及三阴性乳腺癌(triple‐negative breast cancers, TNBC)还没有明显的肿瘤特异性受体或靶向通路，因此在乳腺癌中寻找新的药物靶点具有重要的临床意义。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors, HDACi)是一类新型的小分子治疗药物，在肿瘤治疗方面表现出巨大的前景。丙戊酸(valproic acid, VPA)是一种Ⅰ类HDACi，在癌症表观遗传学研究中得到人们广泛的关注。VPA在体外和体内引起H3和H4的N末端尾部的高度乙酰化，并且通过与酶活性中心结合并阻断底物的进入而抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)活性。与其他HDACi一样,它是一种非细胞毒类抗肿瘤药物，其作用机制主要是，通过改变肿瘤细胞组蛋白乙酰化状态来改变不同基因的转录水平，从而引起广泛的抗肿瘤效应，包括抑制多种肿瘤细胞的增生、促进分化、诱导凋亡，增强化疗和放疗敏感性以及逆转肿瘤转移等。 研究目的： 研究VPA单独或联合X射线照射作用于乳腺癌MCF-7(p53野生型)和MDA-MB-231(p53突变型)细胞的增殖抑制作用，探讨VPA单独或联合X射线照射对两种乳腺癌细胞周期、凋亡、自噬和DNA损伤修复的影响。 研究方法： 1.采用CCK-8法检测不同浓度VPA单独或联合X射线照射对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞作用24、48和72h后的细胞增殖活性。 2.采用PI染色法检测VPA单独或联合X射线照射作用24h后，MCF-7和MDA-MB-231细胞周期分布。 3.采用AnnexinV–FITC法检测VPA单独或联合X射线照射作用24和48h后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的凋亡率。 4.采用MDC染色法检测VPA单独或联合X射线照射作用24和48h后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的自噬率。 5.采用Rh123染色法检测VPA单独或联合X射线作用24和48h后，MCF-7和MDA-MB-231细胞线粒体膜电位变化。 6.采用实时荧光定量PCR法检测VPA单独或联合X射线作用24和48h后，MCF-7和MDA-MB-231细胞周期、凋亡、自噬、DNA损伤修复相关基因的mRNA表达水平。 7.采用蛋白印迹法检测VPA单独或联合X射线作用24和48h后，MCF-7和MDA-MB-231细胞HDAC2、LC3A蛋白表达水平。 8.实验结果使用SPSS24.0软件进行统计分析，实验数据均以均差±标准差((x)±s)表示，多组间样本均数采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 研究结果： 1.VPA联合X射线照射对MCF-7和MDA-MB-231细胞中增殖活性影响不同浓度VPA单独或联合4GyX射线照射作用于MCF-7和MDA-MB-231细胞24、48和72h后，VPA组和VPA联合4GyX射线照射组的细胞增殖率均明显降低(P＜0.01)，且二者联合对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用优于二者单独使用(P＜0.05)。 2.VPA联合X射线照射对MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡率的影响 VPA单独或联合4GyX射线照射作用MCF-7和MDA-MB-231细胞24和48h后，VPA组、X射线照射组和VPA联合X射线照射组凋亡率均明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，且二者联合的细胞凋亡率明显高于X射线单独使用(P＜0.05)。 3.VPA联合X射线照射对MCF-7和MDA-MB-231细胞自噬率的影响 VPA单独或联合4GyX射线照射作用MCF-7细胞24和48h后，X射线照射组、VPA组和VPA联合X射线照射组的细胞自噬率均明显降低(P＜0.05)。 VPA单独或联合4GyX射线照射作用MDA-MB-231细胞24和48h后，X射线照射组、VPA组和VPA联合X射线照射组细胞自噬率均明显升高(P＜0.01)。作用48h后，VPA联合X射线照射组的自噬率高于VPA组(P＜0.05)。 4.VPA联合X射线照射对MCF-7和MDA-MB-231细胞周期的影响 VPA单独或联合4GyX射线照射作用MCF-7和MDA-MB-231细胞24h后，二者联合在MCF-7细胞中引起G1期阻滞，在MDA-MB-231中引起G2/M期阻滞。 5.VPA联合X射线照射对MCF-7和MDA-MB-231细胞膜电位的影响 VPA单独或联合4GyX射线照射作用MCF-7和MDA-MB-231细胞24和48h后，在MCF-7细胞中，X射线照射组、VPA组和VPA联合X射线照射组线粒体膜电位均明显降低(P＜0.05)；在MDA-MB-231细胞中，各组则均明显升高(P＜0.05)。 6.VPA联合X射线照射对MCF-7和MDA-MB-231细胞机制相关研究 VPA单独或联合4GyX射线照射作用MCF-7和MDA-MB-231细胞24和48h后，在MCF-7细胞中，VPA联合X射线照射组的P53、mTOR、Beclin-1、P21、LC3mRNA表达升高(P＜0.05或P＜0.01)，ATM、EGFR、NFκB1、RAD51mRNA表达降低(P＜0.05或P＜0.01)；在MDA-MB-231细胞中，VPA联合X射线照射组的P53、mTOR、Beclin-1、EGFR、NFκB1、RAD51、P21、LC3mRNA表达升高(P＜0.05或P＜0.01)，ATMmRNA表达降低(P＜0.01)。 VPA单独或联合4GyX射线照射作用MCF-7细胞后，VPA联合X射线照射组HDAC2表达降低、LC3A表达升高。 VPA单独或联合4GyX射线照射作用MDA-MB-231细胞后，VPA联合X射线照射组HDAC2表达降低、LC3A表达降低。 结论： 1.VPA通过诱导凋亡、自噬及引起G2/M期阻滞抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖活性；通过诱导凋亡、DNA损伤修复及引起G1期阻滞抑制MCF-7细胞增殖 2.VPA单独或联合X射线照射能有效的抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖活性，且二者联合优于二者单独使用，其机制在于：二者联合引起MDA-MB-231细胞G2/M期阻滞；诱导自噬增加促进细胞死亡。 3.VPA与X射线照射二者联合抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖活性优于二者单独使用，该结果在乳腺癌MCF-7细胞中并不出现，其原因可能在于：两种细胞HDAC2蛋白和P53mRNA表达水平不同所导致。
乳腺癌;电离辐射;丙戊酸;增殖抑制;组蛋白去乙酰化酶抑制剂
吉林大学
硕士
放射医学
王珍琦
2021
中文
R737.9
2021-09-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）