UCP2抑制剂京尼平对人宫颈癌细胞辐射敏感性的影响及线粒体相关机制研究
宫颈癌(cervical cancer)是发生在女性宫颈部位常见的恶性肿瘤，也是全球女性癌症死亡的第二大原因。过早的性行为、多性伴侣、避孕套使用频率低、多次怀孕等因素作用下，使其发病率呈逐年递升的趋势，影响发展中国家许多女性的健康。大部分宫颈癌患者会选择放射治疗，由于耐低氧细胞等因素的存在，使肿瘤细胞辐射敏感性降低，一部分肿瘤细胞不能在放射治疗过程中所被清除，因此提高肿瘤细胞辐射敏感性显得格外重要。 线粒体解偶联蛋白2(UCP2)定位于线粒体内膜，可通过改变细胞内ROS含量影响肿瘤的生长，而UCP2的特异性阻断剂京尼平(Genipin)是一种环烯醚萜葡萄糖苷，分子式为C11H14O5，从茜草科栀子果实中分离得到的活性成分，是一种无毒可食用的染料。近年来发现其对多种肿瘤具有治疗作用，通过抑制UCP2的表达，从而影响活性氧(ROS)的生成，进一步通过改变线粒体功能引起肿瘤细胞的凋亡。本研究以Siha和Me180细胞为主要研究对象，探究UCP2的抑制剂Genipin在辐射敏感性中的作用及线粒体相关机制。 目的： 本课题研究Genipin对人宫颈癌Siha和Me180细胞辐射增敏作用及其相关机制。探讨Genipin是否抑制宫颈癌细胞的增殖并且对宫颈癌细胞辐射敏感性是否有影响。研究Genipin是否通过抑制线粒体UCP2表达来发挥作用，及具体的分子作用机制。 方法： 1.CCK-8法：通过检测Genipin对Siha细胞和Me180细胞的活性影响，得出最佳药物浓度、作用时间和最佳照射剂量； 2.克隆形成法：通过检测Genipin对宫颈癌细胞的集落形成能力，探讨Genipin对宫颈癌细胞辐射敏感性的影响； 3.细胞划痕实验法：检测Genipin对辐射诱导宫颈癌细胞迁移能力的影响； 4.Q-PCR法：检测Genipin对辐射诱导宫颈癌细胞UCP2mRNA表达变化； 5.WesternBlot法：检测Genipin对辐射诱导宫颈癌细胞凋亡、周期相关蛋白以及UCP2蛋白水平变化； 6.利用DCFH-DA探针检测Genipin对辐射诱导宫颈癌细胞的ROS影响； 7.利用罗丹明123(Rhodamine123)染色试剂盒检测Genipin对辐射诱导宫颈癌细胞线粒体膜电位变化； 8.流式细胞术：检测Genipin对辐射诱导宫颈癌细胞凋亡率，周期分布的变化； 9.统计学分析：所有数据用SPSS24.0软件分析，用GraphPadPrism6.0画图。数据采用均数±标准差(???±s)的方式表示。分析不同组间比较采用独立样本T检验；多个组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05被认为具有统计学差异。 结果： 1.Genipin对宫颈癌细胞增殖存活的影响 Siha和Me180宫颈癌细胞的抑制程度随着Genipin浓度的增加、Genipin作用时间的延长以及辐射剂量的增大而增强；Genipin对Siha和Me180宫颈癌细胞的抑制率接近，经过IC50计算得出Genipin对两种宫颈癌细胞的最佳作用浓度分别为145μmol/L和142μmol/L；最佳作用时间为48h；最佳辐照剂量是4Gy；Genipin作用后的Siha和Me180细胞增殖存活能力与阴性对照组相比较有较大程度的降低(P＜0.05)；并且在经过4Gy辐照后，Genipin作用后的Siha和Me180细胞的增殖存活能力降低更为明显(P＜0.05)； 2.Genipin对宫颈癌细胞辐射敏感性的影响 Genipin作用Me180细胞在经过2、4、6、8Gy辐照后，集落形成能力与阴性对照组相比较有较大程度的降低，并且在经过4Gy辐照后，Genipin作用后的宫颈癌细胞的增殖存活能力明显降低； 3.Genipin对辐射诱导宫颈癌细胞迁移能力的影响 Genipin作用后的Siha和Me180细胞，迁移能力与阴性对照组相比较有较大程度的降低(P＜0.05)；并且在经过4Gy辐照后，Genipin作用后的Siha和Me180细胞的迁移能力明显降低(P＜0.05)； 4.Genipin对宫颈癌细胞中UCP2的影响 Genipin作用后的宫颈癌细胞与阴性对照组相比较UCP2mRNA表达水平和蛋白表达水平明显下调(P＜0.05)； 5.Genipin对辐射诱导的宫颈癌细胞凋亡的影响 与阴性对照组相比较Genipin能增加Siha和Me180宫颈癌的凋亡率(P＜0.05)，经过辐照后，Genipin作用后的Siha和Me180宫颈癌细胞的凋亡率明显增加，Genipin增强了辐射诱导的Siha和Me180细胞的凋亡(P＜0.05)，促进了凋亡小体形成相关蛋白及促凋亡相关蛋白表达的增加，抑凋亡蛋白表达的减少； 6.Genipin对辐射诱导的宫颈癌细胞周期的影响 我们通过流式细胞术对Siha和Me180宫颈癌细胞的细胞周期变化进行了检测，Siha和Me180细胞分别在经过4Gy辐照后，会出现较为明显的G2/M期阻滞，经过辐照后，Genipin组阻滞效应更为明显(P＜0.05)；免疫蛋白印迹实验发现：经过辐照后，Genipin组与阴性对照组相比较CyclinB、CDC2蛋白表达降低； 7.Genipin对辐射诱导的宫颈癌细胞的线粒体功能及ROS的影响 Genipin处理Siha和Me180细胞后与阴性对照组比较，膜电位和ROS升高，在辐照后，Genipin组与阴性对照组相比较膜电位和ROS均升高(P＜0.05)。 结论： 1.Genipin对人宫颈癌Siha和Me180细胞的抑制程度和Genipin的浓度、作用时间、辐射剂量呈依赖性；Genipin对人宫颈癌Siha和Me180细胞的抑制程度接近； 2.Genipin对辐射诱导的人宫颈癌Siha和Me180细胞的增殖活性和迁移能力有抑制作用； 3.Genipin可抑制人宫颈癌Siha和Me180细胞中UCP2的生成； 4.Genipin可促进宫颈癌Siha和Me180细胞内膜电位的升高和ROS的生成，结合电离辐射，膜电位升高和ROS生成更显著； 5.Genipin可以促进宫颈癌Siha和Me180细胞发生凋亡和G2期阻滞，辐射诱导的宫颈癌细胞凋亡和G2期阻滞更明显； 总体来说，Genipin通过抑制UCP2促进线粒体ROS生成，进一步影响线粒体诱导的凋亡通路激活。
Genipin;辐射敏感性;UCP2抑制剂;宫颈癌;线粒体
吉林大学
硕士
放射医学
金顺子
2021
中文
R730.55;R737.33
2021-09-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）