番茄丝氨酸乙酰转移酶家族成员分析
硫是植物生长发育中的必需元素之一，对植物的生长代谢有重要作用。半胱氨酸(Cys)是植物将无机硫转变为有机硫的过程中产生的第一个含硫有机物，在植物代谢过程中占据重要位置。半胱氨酸不仅是一种重要的合成蛋白质的氨基酸，同时还是一种重要的还原硫供体分子，是植物生长发育过程中所必须的多种含硫化合物的前体，例如甲硫氨酸、谷胱甘肽、一些重要维生素、硫酯化合物、以及其他含硫衍生物。半胱氨酸合成的过程如下：首先在丝氨酸乙酰转移酶(Serine acetyltransferase，SERAT)的催化下，丝氨酸与乙酰辅酶A结合生成O-乙酰丝氨酸(O-acetylserine，OAS)，然后在O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(Oacetylserine (thiol)lyase，OASTL)的催化和5''-磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5''-phosphate，PLP)的辅助下，OAS结合硫化物生成半胱氨酸。本文研究对象SERAT催化半胱氨酸合成的第一步反应，是半胱氨酸合成过程中的限速步骤，因此SERAT是一个限速酶。此前关于SERAT的研究大多集中于模式植物拟南芥中，在具有经济意义的农作物中研究很有限。番茄是一种重要的果蔬类作物，在番茄中系统地研究SERAT家族成员功能，能帮助我们了解番茄中硫代谢过程，挖掘更多重要功能基因信息，为番茄的定向遗传育种提供理论支持。 本文以MicroTom番茄型作为研究材料，从生物信息学、生物化学、分子水平、细胞水平等方面对番茄SERAT家族成员(SlSERATs)进行了系统的研究。研究结果如下： 1.在番茄中克隆并鉴定出4个SERAT家族成员，从系统发育上看，这4个SlSERATs蛋白被分为三个亚支，并因此将其命名为SlSERAT1;1、SlSERAT2;1、SlSERAT2;2和SlSERAT3;1。基因结构分析结果显示，属于不同亚类的番茄SERATs具有独特的外显子-内含子结构，类似于它们各自的拟南芥同源物。多重蛋白序列比对结果显示：SlSERATs中N端α-螺旋和C端β-折叠是保守的。与番茄其他SERAT成员相比，SlSERAT3;1具有扩展的C末端，但重要的异亮氨酸(Ile)位点仍保留在其蛋白质序列中。 2.亚细胞定位结果显示，SlSERAT1;1定位于线粒体；SlSERAT2;1、SlSERAT2;2定位于叶绿体；而SlSERAT3;1定位于细胞质。 3.通过原核表达，体外获得了4个番茄SERAT家族成员的重组蛋白。酶活分析结果表明在没有OASTL蛋白存在的情况下，除S1SERAT2;1以外，所有番茄SERAT蛋白都表现出一定的催化OAS生成的能力。其中，SlSERAT2;2具有最高的催化能力。当将SlOAS6蛋白添加到反应中时，所有SlSERAT蛋白的催化能力都有提高，其中SlSERAT1;1和SlSERAT2;1的活性显著增加，S1SERAT1;1表现出最强的催化OAS形成的能力。 4.双分子荧光互补实验结果表明番茄SERAT家族的4个蛋白均能与番茄OASTL家族蛋白发生互作。该结果与上一步酶活分析结果相吻合。进一步的表达模式分析结果表明，在转录水平上，四个SlSERAT基因在番茄植株发育过程中具有不同的表达模式。在非生物胁迫下，叶绿体定位的SlSERATs是主要响应者，而其他的SlSERATs则采用不同的策略来应对渗透胁迫、离子毒性等不良环境影响。 5.为探索番茄SERAT家族成员在植物生长发育过程中的功能，构建了SlSERAT1;1和SlSERAT2;2过表达载体和基于CRISPR/Cas9技术的基因编辑载体，并采用农杆菌介导法转化番茄，得到T0代转基因植株。
番茄;丝氨酸乙酰转移酶;亚细胞定位;酶活性;功能基因
山西大学
硕士
植物学
刘旦梅
2021
中文
S641.2
2021-09-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）