黄芪活性多糖APS-II免疫调控机制及其酶解寡糖片段的结构和活性研究
黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）具有广泛的生物活性，目前大多数研究以黄芪总多糖作为主要的研究对象，但黄芪多糖相对分子量分布广泛，限制了对其生物活性作用机制的深入研究，无法精确阐明免疫调节作用与其相对分子质量的关系，也难以揭示黄芪多糖在分子水平发挥免疫调节作用的机制。 本课题组前期研究表明黄芪多糖APS-II是黄芪中免疫调节活性主要物质，由于多糖结构难于精确测定，限制了黄芪多糖体内分子作用机制的深入研究。“多糖受体学说”认为免疫活性多糖分子中存在一种或多种寡糖片段“活性中心”，因此将黄多糖降解为寡糖，从寡糖水平研究多糖的活性中心，为突破黄芪多糖结构研究和作用机制研究提供了新思路。 目的：超滤技术分离获得不同分子量黄芪多糖，采用“环磷酰胺免疫抑制”方式造模，通过小鼠血清代谢组学技术探讨黄芪多糖的免疫增强作用机制。将本课题组已制备的免疫活性多糖APS-II（10kDa组分）通过单因素试验和正交试验确定最佳降解条件，通过聚丙烯酰胺凝胶色谱制备不同聚合度寡糖组分，对不同聚合度寡糖组分进行结构分析及免疫活性筛选。 方法：（1）通过超滤法将黄芪总多糖得到不同分子量黄芪多糖APS-I（>2000kDa）、APS-II（1.02×104Da）、APS-III（286Da），分别作用于“环磷酰胺免疫抑制”模型小鼠，收集小鼠血清进行UPLC-HRMS检测，结合多元统计分析探讨黄芪多糖的免疫增强作用机制。 （2）免疫活性多糖APS-II采用内切α-1,4-葡聚糖酶酶解，通过单因素试验和正交试验确定最佳降解条件，降解后的寡糖混合物通过聚丙烯酰胺凝胶色谱制备不同聚合度寡糖组分。对不同寡糖组分结构进行分析，通过高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）确定单糖组成，通过甲基化方法确定寡糖结构中单糖连接方式，通过红外光谱（IR）确定APS-II降解后寡糖的特征官能团和糖链构型，通过核磁共振波谱（NMR）确定APS-II降解后寡糖片段的糖苷键构型，通过质谱法（MS/MS）确定APS-II降解后寡糖片段的精细结构。 （3）从机体特异性免疫和非特异性免疫两方面对不同寡糖片段活性进行研究，通过不同寡糖组分对Raw264.7细胞吞噬活性和自然杀伤细胞（NK）的作用，探究它们对机体非特异性免疫功能的影响；通过不同寡糖组分协同伴刀豆蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）对小鼠脾淋巴细胞的作用，探究它们对机体特异性免疫功能的影响。 结果：1．不同分子量黄芪多糖均可不同程度提高小鼠血清中免疫细胞数量，改善免疫器官损伤，其中APS-II效果最佳。与空白组相比，模型组小鼠血清中29个代谢物发生显著变化，APS、APS-I、APS-II、APS-III分别能显著回调其中24、13、25、19个代谢物至正常水平。代谢组学分析揭示了黄芪多糖中APS-II是发挥免疫调节活性的主要成分，其机制可能与调控小鼠体内苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢、三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢有关。 2．通过单因素试验和正交试验确定了APS-II最佳降解条件，在内切α-1,4-葡聚糖酶浓度0.5U?ml-1，酶解温度60℃，酶解时间90min下，APS-II降解得到的寡糖数量最多，含量最高，且降解一致性较好，寡糖混合物通过聚丙烯酰胺凝胶色谱分离得到四个寡糖组分，P1：1-3糖，P2：3-6糖，P3：7-14糖，P4：10-18糖。 3．APS-II经内切α-1,4-葡聚糖酶降解后形成聚合度1-18的寡糖，经聚丙烯酰胺凝胶色谱分离得到四个组分，对APS-II降解后寡糖混合物结构的结构进行分析，APS-II酶降解后产生的1-3糖、3-6糖和7-14糖主要成分为葡萄糖，而10-18糖和酶降解后总的寡糖混合物中除葡萄糖外，还存在其余单糖，其中半乳糖和阿拉伯糖含量较多。其中聚合度1-3糖和3-6糖主要结构为线性1,4-连接葡聚糖；聚合度7-14糖主要结构为线性1,4-连接葡聚糖，但相较于1-6糖，其糖链结构中分支度高的葡萄糖单糖数量增加，此外出现少量阿拉伯糖和半乳糖；聚合度10-18寡糖组分中，糖链主要连接方式为1→2,4-Glcp和1→4,6-Glcp，与前三个寡糖组分糖相比，1→4-Glcp和1-Glcp含量明显降低，半乳糖和阿拉伯糖含量增加，分支度高的葡萄糖成为糖链中主要成分。综合酶解产物结构可推测黄芪活性多糖APS-II的结构，以α-D-1,4-连接葡聚糖为主链，主链包含连续线性九糖的直链结构和糖环C2位、C3和C6位的支链结构，此外多糖结构中还存在少量1,5-连接阿拉伯糖，1-连接阿拉伯糖以及2,3,4-连接半乳糖，2,4,6-连接半乳糖。 4．APS-II酶降解产物均可通过增强巨噬细胞的吞噬功能，增强NK细胞的杀伤活性，促进非特异性免疫功能，还可以协同ConA促进小鼠脾淋巴细胞增殖，协同LPS促进小鼠脾淋巴细胞增殖并分泌细胞因子IgG，增强特异性免疫功能，不同寡糖组分中活性最强的为糖链C-2和C-6位存在支链的α-D-1,4-连接葡聚糖10～18寡糖组分。 结论：代谢组学分析揭示了黄芪多糖中APS-II是发挥免疫调节活性的主要成分，其机制可能与调控小鼠体内苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢、三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢有关，因此推测黄芪多糖在体内发挥免疫活性的主要方式可能为：通过调节吞噬细胞和树突状细胞的活性，直接影响机体的非特异性免疫，通过相关代谢产物间接影响机体的特异性免疫，最终表现出较强的整体免疫功能修复活性。在“多糖受体学说”理论指导下，初步建立了活性黄芪多糖APS-II的酶降解获得寡糖的方法，并对降解后的寡糖分离，初步探究了不同聚合度寡糖混合物的免疫活性，结果发现与免疫活性多糖APS-II相比，不同寡糖组分在不同免疫活性有明显差异，其中聚合度10～18寡糖免疫活性最高，结合结构解析结果可知，相较于低聚合度寡糖，10～18寡糖结构为糖链C-2和C-6位存在支链的α-D-1,4-连接葡聚糖，且支链结构较多，表明带有支链结构的α-D-1,4-连接葡聚糖结构具有免疫增强活性，其中糖链C-2和C-6位存在支链的α-D-1,4-连接葡聚糖免疫活性较强。因此推测免疫活性多糖APS-II多糖分子中的寡糖片段“活性中心”可能位于寡糖10-18糖结构中。本研究结果为进一步阐明黄芪多糖结构与功能奠定了基础，丰富了多糖受体学说，也为黄芪多糖的开发提供了新思路。
黄芪多糖;免疫增强作用;代谢组学;寡糖组分
山西大学
硕士
药物化学
李科
2021
中文
R282.71
2021-09-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）