黄花菜抗肿瘤活性蛋白的分离纯化及抑制肝癌细胞增殖的机制研究
肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)，是我国常见的恶性上皮细胞性肿瘤，其发病与肝硬化、酗酒、遗传突变、病毒感染和化学致癌物等有关。目前肝癌的主要治疗方法包括手术治疗和化疗等，但这些方法对人体具有较大的毒副作用，因此很大程度上限制了在临床上的应用。最新研究表明，从一些植物中提取的蛋白除了具有抗肿瘤活性外，还具有副作用小等特性，这将为生物学和医学领域对天然产物中化学物质的提取提供新的思路与见解。黄花菜(Hemerocallis citrina Baroni, HcB)，是一种百合科萱草属多年生的宿根草本植物。黄花菜营养丰富，含有蛋白质、糖类、维生素、多酚类、萜类、蒽醌类、甾体、皂苷、生物碱等多种生物活性物质，具有安神、止血、抗炎抗氧化、消食、清热、抗抑郁的功效，因此黄花菜是一种药食同源的物质。已有报道称黄花菜提取液具有抗癌活性，但对于从黄花菜中提取的蛋白质的抗肿瘤活性研究甚少。因此，本论文拟从黄花菜中分离纯化出一种抗肿瘤活性蛋白，并研究其抑制肝癌细胞增殖的机制。主要研究内容包括以下三部分： 第一部分：黄花菜抗肿瘤活性蛋白的分离纯化。结合细胞存活实验(MTT法)，采用磷酸盐缓冲液抽提和丙酮沉淀法对黄花菜的蛋白进行粗提取，然后进一步采用饱和硫酸铵沉淀法，并通过两次阳离子交换层析柱对得到的粗蛋白进行进一步的分离纯化，获得一种抗肿瘤活性蛋白，命名为HcBP。用不同浓度的HcBP分别处理正常肝细胞(HL7702)和肝癌细胞(HepG2和Bel-7402)，然后检测HcBP对肝癌细胞增殖的影响。细胞存活分析表明，HcBP可以明显抑制肝癌细胞的存活，而对肝正常细胞的存活没有显著影响。进一步采用细胞克隆形成实验检测HcBP对肝癌细胞HepG2和Bel-7402增殖的影响，结果表明，HcBP可以显著抑制HepG2和Bel-7402细胞的克隆形成能力。这些结果表明HcBP是一种有效、副作用小的抗肿瘤活性蛋白。HcBP经过质谱和紫外光谱扫描显示，该蛋白与拟南芥中的过氧化物酶相似，且含有血红素辅基，过氧化物酶活性检测发现HcBP具有明显的过氧化物酶活性。 第二部分：HcBP通过线粒体介导的途径诱导肝癌细胞凋亡。采用DAPI染色和流式细胞术检测HcBP对肝癌细胞HepG2和Bel-7402凋亡的影响，结果显示HcBP可以明显诱导HepG2和Bel-7402细胞凋亡。最后检测了HcBP对肝癌细胞HepG2和Bel-7402ROS水平和凋亡过程中关键蛋白的影响，结果显示HcBP作用于HepG2 和Bel-7402细胞后，细胞内的ROS水平显著升高，此外，Western印迹结果显示，HcBP作用于HepG2和Bel-7402细胞后，Activated-caspase-9、Activate-caspase-3、Cytochromec和Bax的蛋白水平显著上调，而Bcl-2的蛋白水平显著下调。上述结果表明，HcBP通过线粒体凋亡途径抑制HepG2和Bel-7402细胞凋亡。 第三部分：HcBP通过调节PKM2抑制肝癌细胞有氧糖酵解。用不同浓度的HcBP作用于肝癌细胞HepG2和Bel-7402，收集细胞培养液，检测培养液中葡萄糖残余量和乳酸生成量，结果表明，HcBP处理两株肝癌细胞后，培养液中葡萄糖的残余量显著上升，而乳酸的生成量显著下降。然后采用实时荧光定量PCR法检测不同浓度HcBP作用于肝癌细胞HepG2和Bel-7402后，有氧糖酵解有关的关键蛋白葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、乳酸脱氢酶(LDHA)和丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)的mRNA水平，结果表明，HcBP处理后，明显降低了GLUT1、LDHA和PDK的mRNA水平。采用Western印迹法检测不同浓度的HcBP作用于肝癌细胞HepG2和Bel-7402后，细胞中丙酮酸激酶(PKM2)的蛋白水平的变化和丙酮酸激酶活性，结果表明，HcBP处理后，不仅显著降低细胞中总PKM2蛋白水平，而且明显降低了细胞核和细胞质中的PKM2蛋白水平，此外，HcBP也显著抑制了丙酮酸激酶(PKM2)的活性。这些结果表明，HcBP可以明显抑制HepG2和Bel-7402细胞的有氧糖酵解，并且显著抑制了PKM2的表达、核异位及其活性。采用细胞转染的方法在HepG2和Bel-7402细胞中过表达PKM2后，检测HcBP对葡萄糖消耗，乳酸生成，PKM2和有氧糖酵解关键蛋白的影响，结果表明过表达PKM2后，原来由于HcBP处理HepG2和Bel-7402细胞后培养基中葡萄糖残余量显著上升，乳酸生成量明显下降的现象得到了显著的逆转，此外，与有氧糖酵解有关的关键蛋白GLUT1、LDHA、PDK的mRNA水平降低的现象也得到了显著的逆转。因此，这些结果表明，HcBP通过调节PKM2抑制HepG2和Bel-7402细胞的有氧糖酵解。 综上所述，本研究从黄花菜中分离纯化出一种有效、副作用小的抗肿瘤活性蛋白，并命名为HcBP。经研究表明，HcBP可以明显抑制肝癌细胞的增殖并诱导肝癌细胞的凋亡，此外，HcBP可以通过调节PKM2的表达进而来抑制肝癌细胞的有氧糖酵解。
黄花菜;抗肿瘤活性蛋白;肝癌;细胞凋亡;分离纯化
山西大学
硕士
微生物学
宋莉
2021
中文
R735.7
2021-09-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）