丙酮丁醇梭菌纤维二糖转运系统的鉴定及其调控研究
能源是人类赖以生存和发展的物质基础，但是随着能源过度的开发利用，对全球环境造成的污染问题越发严重，所以开发绿色无污染的可再生能源成为全球发展的共同需要。有着绿色能源之称的生物燃料受到各国政府以及研究学者的高度重视，其最大的特点是燃烧和使用不会造成环境的污染，有利于维持生态环境的平衡。生物丁醇被认为是能量高并且有较好的燃料经济性的液体燃料，其生产来源是ABE（Acetone-Butanol-Ethanol）发酵。ABE发酵的主要生产菌株有丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）。其中丙酮丁醇梭菌能够利用各种单糖、二糖和多糖进行ABE发酵产生丁醇以及丙酮和乙醇等副产物。本研究以C.acetobutylicum ATCC824为研究对象，对其纤维二糖转运系统及其调控机制进行了研究，主要研究工作以及结果如下： 首先，通过文献调研和qPCR分析发现两个编码PTS（phosphotransferase system）系统基因簇（CAC0383-0386和CAC1407-1408）在纤维二糖下特异性高表达。利用ClosTron敲除技术分别将CAC0383和CAC1407插入失活以及将CAC0383和CAC1407共敲除，发现单突变体菌株和双突变体菌株中对应敲除基因的下游基因转录水平都有所降低；同时两个单突变体均可以利用纤维二糖，而共敲除CAC0383和CAC1407的双突变体不能利用纤维二糖。因此，C.acetobutylicum ATCC824基因簇CAC0383-0386和CAC1407-1408均编码转运纤维二糖的PTSs（分别命名为PTS1ceb和PTS2ceb）。 其次，对PTS1ceb和PTS2ceb可能转运的糖进行筛选。选择除了葡萄糖和纤维二糖以外的丙酮丁醇梭菌可以利用的二糖（蔗糖、乳糖）、戊糖（阿拉伯糖、木糖）、已糖（半乳糖）和多糖（木聚糖）进行生长比较，最终发现CAC0383基因被敲除的菌株不能利用半乳糖，而CAC1407基因被敲除时对半乳糖的生长没有影响，因此PTS1ceb还负责半乳糖转运。 最后，在C.acetobutylicum中成功建立了基于upp（编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶）的反向筛选系统。C.acetobutylicumΔupp确实能够在含有5-氟尿嘧啶（5-Fu）的培养基中生长，而将upp基因回补则不能生长。因此，可通过加入5-Fu快速实现含upp基因的质粒或片段丢失。同时，基于ClosTron敲除技术，建立将外源基因定点插入到基因组的目标位置的基因敲入技术。 总而言之，该研究不仅鉴定了丙酮丁醇梭菌纤维二糖的转运系统和分析了其表达调控机制，同时将ClosTron和upp/5-Fu反向筛选系统结合开发了一个新的基因快速插入策略。这些研究不仅为丙酮丁醇梭菌高效利用木质纤维素奠定了基础，也为其他梭菌的遗传改造提供了便利条件。
生物丁醇;丙酮丁醇梭菌;纤维二糖转运系统
山西大学
硕士
微生物学
许成钢
2021
中文
TQ923
2021-09-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）