鼠李糖乳杆菌酯酶酶学性质表征与N-末端α-螺旋功能性作用研究
鼠李糖乳杆菌酯酶是源于乳杆菌属的酯酶，在工业中常用于催化生成酯类风味物质，以改善产品品质及风味，具有广阔的应用前景。目前来源于乳杆菌属的酯酶有16个已表征酶学性质，3个已进行结构解析。鼠李糖乳杆菌GG作为一种益生菌，其关于酯酶的研究与乳杆菌属中其他菌种相比相对较少，我们的研究有助于开发拓展鼠李糖乳杆菌酯酶资源的利用。本课题主要研究结果如下： (1)LggEst1、LggEst2酶学性质表征：LggEst1和LggEst2的最适温度均为50℃，最适pH分别为pH7.5和6.5。LggEst1偏好水解中链底物，对pNPC8催化效率最大，达3.1×105M-1s-1；LggEst2偏好水解中长链底物，对pNPC10催化效率最大，达3.0×106M-1s-1。LggEst2热稳定性远优于LggEst1，45℃条件下其半衰期为约6h。DOC抑制LggEst1活力，对LggEst2则表现为低温抑制高温增强。10%、20%乙二醇对LggEst1和LggEst2活力均表现出不同程度的激活，二者对DMSO也表现出良好的耐受性。LggEst1和LggEst2均为α/β水解酶折叠，含有丝氨酸-天冬氨酸-组氨酸的催化三联体，分别为Ser94-Asp188-His219和Ser146-Asp243-His278。LggEst1底物结合口袋呈现单一的细深隧道洞状。LggEst2底物结合口袋则被催化中心一分为二，形如裂缝，一侧为酰基结合区域一侧为醇基结合区域。 (2)LggEst2N-末端α-螺旋功能作用研究：利用POE-PCR方法重新构建了LggEst2野生型与删除N-末端α-螺旋的突变体，经蛋白异源表达与纯化后发现删除突变同时下调了蛋白表达量及可溶性。利用CD研究结构变化，发现删除突变并未影响酶的α/β折叠，活性中心结构也保持完整。野生型和删除突变体的最适pH分别为6.5和5.5；二者最适温度均为45℃；酶动力学和底物特异性研究证明删除突变并未改变酰基链长的偏好性；DOC对野生型表现为低温抑制高温增强，对删除突变体则是均增强其活力；此外相比野生型，删除突变体对有机溶剂和表面活性剂抗性降低。热稳定性和化学稳定性的研究表明N-末端α-螺旋的删除不影响蛋白整体结构的折叠，但使活性中心稳定性下降。整体研究揭示N-末端α-螺旋对调控LggEst2蛋白表达、催化活性和稳定性具有重要意义。
酯酶;酶学性质;删除突变;N-末端α-螺旋
山西大学
硕士
微生物学
李彬春
2021
中文
TQ925
2021-09-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）