两亲性鲁米诺/二氢卟吩e6偶联物自组装纳米粒的构建及其防治动脉粥样硬化的作用与机制研究
心血管疾病是全世界最常见的死亡原因，主要并发症为缺血性中风、心肌梗死和外周血管疾病。在与心血管疾病相关的死亡中，约50%是由冠状动脉病变引起的。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是引起冠状动脉病变的病理生理基础，是心血管疾病发展过程中最重要的病理过程。动脉粥样硬化致病因素很多，如血脂异常、血糖异常、高血压、肥胖和糖尿病等。现有研究证实，动脉粥样硬化不仅与代谢障碍相关，也是动脉壁的慢性炎症过程，是由血液中的脂蛋白在受损的内皮下沉积引起的。血液中单核细胞受到炎症影响透过活化内皮细胞进入内膜，分化成巨噬细胞。巨噬细胞氧化沉积的脂质并将其吞噬入胞形成泡沫细胞，诱导脂纹形成，这是动脉粥样硬化发展的开始。除此之外，被巨噬细胞氧化的脂蛋白进一步诱导泡沫细胞坏死，形成坏死核心，促进斑块破裂引发血栓生成，加速动脉粥样硬化发展进程。目前治疗动脉粥样硬化的药物主要有调节血脂类、抗氧化剂类、抗血小板类、扩张血管类和抗炎类。但是这些药物会导致肝肾功能异常、消化道出血、腹泻和低血压等副作用，限制了它们在临床广泛使用。因此靶向药物成为治疗动脉粥样硬化的研究热门。 我们课题组前期合成了两亲性二氢卟吩e6(Ce6)、鲁米诺和聚乙二醇(PEG)偶联物(CLP)，发现该药物具有抗炎和抑制中性粒细胞和巨噬细胞迁移的作用。动脉粥样硬化是一个慢性的炎症过程。血管内皮细胞受到炎症影响，内皮功能发生障碍，循环低密度脂蛋白渗入血管内膜后被氧化。经过氧化修饰的低密度脂蛋白激活免疫细胞，导致趋化因子和粘附分子的表达，吸引单核细胞聚集到内皮损伤部位，使它粘附并迁移至内膜。此时单核细胞分化为巨噬细胞。巨噬细胞在内膜下迁移并吞噬氧化低密度脂蛋白后形成泡沫细胞。积累的泡沫细胞坏死后，逐渐形成血栓和促炎坏死核心，促进斑块破裂引发血栓生成，导致动脉粥样硬化进一步发展。因此我们设想CLP纳米粒具有抗炎作用，且能抑制巨噬细胞迁移，那么CLP纳米粒是否具有靶向斑块达到防治动脉粥样硬化的效果。是否在加入靶向基团后增强纳米粒的疗效。 方法 1.CLP及CLP-cRGD偶联物的合成与表征 使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化Ce6羧基后，分别与鲁米诺和甲氧基氨基聚乙二醇的氨基缩合得到两亲性CLP偶联物。使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化Ce6羧基后，分别与鲁米诺和马来酰亚胺氨基聚乙二醇的氨基缩合得到两亲性CLP-MAL偶联物。继续在CLP主链上通过马来酰亚胺(MAL)和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽(cRGD)的巯基键合得到CLP键合cRGD聚合物(CLP-cRGD)。通过对CLP和CLP-cRGD偶联物的红外光谱、核磁图谱、基质辅助激光解析电离飞行时间图谱、紫外吸收光谱和荧光光谱分析验证其结构。 2.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒的合成及表征 将CLP和CLP-cRGD偶联物溶于水溶液中即可获得自组装CLP纳米粒(CLP NP)和CLP-cRGD纳米粒(CLP-cRGD NP)。通过透射电镜和马尔文粒径仪对纳米粒的粒径分布、粒径大小及Zeta电位进行测定。 3.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒在动脉粥样硬化斑块中的靶向效应和脏器组织分布 摘取动脉粥样硬化治疗结束后的小鼠心脏、主动脉和主要脏器进行活体成像和共聚焦成像，考察CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒对心脏和血管中斑块的靶向作用和脏器分布情况。 4.CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化药效学研究 使用ApoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型。采用尾静脉注射(i.v.)、腹腔注射(i.p.)和口服给药(p.o.)三种给药方式，给予CLP纳米粒治疗80天后，测定主动脉、主动脉根及头臂干的斑块面积，考察主动脉根斑块稳定性，确定CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化的有效给药方式。 5.CLP-cRGD纳米粒治疗动脉粥样硬化药效学研究 ApoE-/-小鼠成功建立动脉粥样硬化模型后，尾静脉分别给予CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒治疗60天。测定主动脉、主动脉根和头臂干斑块面积，考察主动脉根斑块稳定性，评价CLP纳米粒及CLP-cRGD纳米粒的药效。 6.CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化机制研究 采用与动脉粥样硬化相关的小鼠巨噬细胞(RAW.264.7细胞)、小鼠主动脉血管内皮细胞(MOVAS细胞)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)，验证CLP纳米粒在细胞中的吞噬效应。采用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞建立炎性细胞模型，通过趋化因子蛋白芯片筛选出CLP纳米粒处理后变化最显著的MIP-2蛋白，并使用ELISA试剂盒、荧光定量PCR和Westernblot验证其结果。使用炎症模型，验证CLP纳米粒对炎症因子的影响。使用单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和胎牛血清(FBS)作为趋化因子，验证CLP纳米粒对RAW26.47细胞、MOVAS细胞和中性粒细胞迁移的影响。使用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导泡沫细胞形成，验证CLP纳米粒对泡沫细胞形成的影响。 7.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒初步安全性评价 通过CCK8法检测CLP纳米粒对RAW264.7细胞和MOVAS细胞的毒性作用。ApoE-/-小鼠抗AS治疗结束后，记录体重变化、统计脏器指数、分析血常规和肝肾功能及观察主要脏器H&E染色，考察CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒治疗AS的安全性。Balb/c小鼠尾静脉一次性分别给予1000mg/kg、500mg/kg和250mg/kgCLP纳米粒，统计15天体重变化和脏器指数，统计血常规和生化指标，观察主要脏器H&E染色，考察CLP纳米粒急性毒性实验。 结果 1.光谱结合质谱分析Ce6、鲁米诺和甲氧基氨基聚乙二醇能成功构建CLP偶联物。利用马来酰亚胺可将cRGD环肽键合到CLP主链上，成功构建CLP-cRGD聚合物。CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒的平均粒径分别为170±4nm和156±3nm，表面电位(Zeta电位)分别为-19.2±0.2mV和-16.1±0.3mV。 2.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒均能靶向到血管斑块部位。引入cRGD靶向单元后，CLP-cRGD纳米粒增强了纳米粒的斑块靶向效应。静脉注射CLP纳米粒能抑制动脉粥样硬化斑块生成，维持斑块稳定。CLP-cRGD纳米粒与之相比，效果更佳。 3.CLP纳米粒能被RAW264.7巨噬细胞、MOVAS细胞和HUVEC细胞吞噬入胞发挥作用。CLP纳米粒能降低炎症细胞中巨噬细胞炎性蛋白-2(Macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)和炎症因子的含量。CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒均能有效抑制RAW264.7巨噬细胞、MOVAS细胞和腹腔中性粒细胞迁移，并且CLP-cRGD纳米粒的抑制效果更强。CLP纳米粒还能有效抑制RAW264.7巨噬细胞摄取oxLDL，抑制泡沫细胞形成。 4.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒在体内外具有良好的安全性。 研究结论 1.本课题成功构建了CLP偶联物和CLP-cRGD聚合物。 2.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒能靶向到斑块部位，与CLP纳米粒相比，CLP-cRGD纳米粒靶向性更强。静脉注射CLP纳米粒能有效治疗动脉粥样硬化。增加靶向单元的CLP-cRGD纳米粒治疗效果更好。 3.CLP纳米粒能有效抑制小鼠巨噬细胞(RAW.264.7细胞)、小鼠主动脉血管内皮细胞(MOVAS细胞)和腹腔中性粒细胞等炎性相关细胞迁移，且靶向纳米粒抑制效果更加显著。除此之外，CLP纳米粒还能有效抑制泡沫细胞形成，降低炎症细胞分泌的炎症因子和趋化因子MIP-2含量，抑制动脉粥样硬化发展。 4.初步的体内外实验研究结果表明，CLP纳米粒在组织和细胞方面具有良好的安全性。
动脉粥样硬化;鲁米诺;二氢卟吩e6;巨噬细胞;靶向治疗;纳米粒
陆军军医大学
博士
药剂学
张建祥
2020
中文
R543.5
2021-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）