Caco-2和MDCK细胞模型研究结合雌激素的吸收机制及肠道渗透性
目的：基于Caco-2和MDCK单层细胞模型研究CE的肠吸收机制，并与4种模型药物(美托洛尔、米诺地尔、阿替洛尔、阿米洛利)的吸收方向的渗透性进行比较，确定CE的渗透性分类等级，为CE的BCS分类提供依据。方法：1.建立CE中两种主要成分(ES和EqS)及4种模型药物的细胞渗透液样品的HPLC分析方法并验证。2.通过观察细胞形态、测定跨膜电阻(TEER)值、荧光素钠标记物透过量检测，评价单层细胞模型。3.MTT法探究CE及4种模型药物在两种细胞的安全给药范围。4.通过双向转运实验，时间、浓度、P-gp抑制剂(100μM维拉帕米和10μM环孢素A)、ES和EqS单一化合物的影响因素实验，探究CE在单层细胞膜的转运机制。5.比较CE及4种模型药物在Caco-2细胞吸收方向的Papp，比较CE与阿替洛尔在MDCK细胞吸收方向的Papp，综合分析确定CE的渗透性分类等级。结果：1.对建立的CE及4种模型药物的细胞渗透液样品的HPLC检测方法的系统适用性、专属性、线性、精密度、稳定性、提取回收率验证结果均符合2015版药典关于生物样品分析方法验证的指导原则要求。2.光学倒置显微镜下Caco-2和MDCK细胞间紧密排列，无缝隙；Caco-2单层细胞TEER＞600Ω·cm2、MDCK细胞TEER>1000Ω·cm2,标志物荧光素钠的Papp值为(0.59±0.08)×10-6cm/sec；3.MTT结果显示，Caco-2细胞中CE浓度1~1600μg/mL、4种模型药物浓度均在1~800μg/mL范围内，MDCK细胞中CE浓度1~1600μg/mL、阿替洛尔1-800μg/mL为安全给药浓度范围。4.在Caco-2单层细胞模型中，双向转运试验CE的外排比ER=2.60，P-gp抑制剂作用后(100μM维拉帕米做作用后ER降低至0.21；10μM环孢素A作用后ER降低至0.43)均增大吸收方向Papp，抑制分泌方向，ER显著降低，表明CE是P-gp的底物。时间与浓度相关性考察结果显示：Papp随时间的延长和浓度增大而增大，且未出现饱和现象，综上可认为CE是以被动转运为主，存在P-gp介导的的外排作用。分析比较单一化合物ES、EqS、ES+EqS和CE喷干粉原料药4组结果，结果显示CE喷干粉原料药的渗透性显著低于ES+EqS，且EqS的渗透性显著大于其余三组。在MDCK单层细胞模型中，双向转运试验CE的外排比ER=3.30，P-gp抑制剂10μM维拉帕米作用后ER降低至0.46，增大吸收向Papp，抑制分泌向，ER显著降低，证明CE确实是P-糖蛋白的底物。分析比较单一化合物ES、EqS、ES+EqS和CE喷干粉原料药，结果显示CE喷干粉渗透性也低于ES+EqS；且EqS、ES、ES+EqS三组间无显著性差异。5.Caco-2细胞模型中，CE和阿替洛尔无显著性差异，p＞0.05。CE与美托洛尔、米诺地尔、阿米洛利有显著性差异，p＜0.05，CE的Papp低于这三种模型药物。MDCK细胞模型中，CE和阿替洛尔无显著性差异，p＞0.05，表明CE和阿替洛尔的渗透性相当。结论：1.建立的HPLC分析方法准确可靠，可用于细胞模型样品的检测。2.建立的Caco-2和MDCK细胞模型评价指标符合要求，可满足药物后续吸收特性研究的要求。3.实验所用CE和4种模型药物给药浓度均在安全范围内。4.CE的渗透性机制是以被动转运为主，存在P-gp介导的外排作用。5.CE的吸收向Papp低于美托洛尔、米诺地尔、阿米洛利，和中渗透型模型药物阿替洛尔相当。
结合雌激素;Caco-2单层细胞模型;MDCK单层细胞模型;阿替洛尔;肠道渗透性
新疆医科大学
硕士
药剂学
高晓黎
2020
中文
TQ460.1
2021-08-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）