异叶青兰总黄酮体外抗氧化及对H9c2心肌细胞的抗炎抗凋亡作用研究
目的：本研究主要通过对异叶青兰总黄酮体外抗氧化活性的考察，以及异叶青兰总黄酮(DHBF)对LPS及H2O2诱导的H9c2心肌细胞的影响及作用机制研究，以期为该药材的开发利用提供参考依据。 方法： 1.采用70%乙醇回流提取，AB-8大孔吸附树脂纯化制备DHBF，通过硝酸铝比色法测定DHBF含量，并建立方法学考察。 2.以维生素C作为阳性对照，通过考察DHBF对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，以及总抗氧化能力(T-AOC)，评价其体外抗氧化活性。 3.以10μg/mL的脂多糖(LPS)诱导H9c2细胞建立炎症模型，以300μM过氧化氢(H2O2)诱导H9c2细胞，建立H9c2细胞损伤模型。 4.采用细胞增殖-毒性检测法(CCK-8)检测不同浓度DHBF对H9c2心肌细胞活性的影响，以及DHBF对H2O2诱导H9c2细胞存活率的影响。 5.利用ELISA法检测IL-6、IL-1β、IL-10以及TNF-α等炎症因子的分泌。 6.采用细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒检测细胞凋亡情况。 7.采用激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位(JC-1 )。 8.采用Westernblot法检测TLR4，MyD88，NF-κB，Bax、Caspase-3的蛋白表达水平。 结果： 1.DHBF平均含量为48.6%，其对DPPH和ABTS自由基清除率可高达82.94%和98.47%，IC50值分别为0.063mg/mL和0.079mg/mL。总抗氧化能力(T-AOC)达5.81μmol/mL。 2.CCK-8结果表明，当浓度≦50μg/mL时，其对H9c2细胞的活性无抑制现象。与正常组相比，H2O2模型组H9c2细胞存活率显著下降(P＜0.05)，不同浓度的DHBF均可以提高H2O2诱导的H9c2细胞存活率，其中25、50μg/mL的DHBF可以显著提高H2O2诱导的H9c2细胞存活率(P＜0.05)。 3.与正常对照组相比，LPS模型组细胞上清液中IL-6、IL-1β及TNF-α表达显著提高(P＜0.01)，IL-10的表达显著降低(P＜0.01)。给予不同浓度DHBF的H9c2细胞组，均能够降低IL-6、IL-1β以及TNF-α的表达。其中25、50μg/mL的DHBF能够显著降低IL-6、IL-1β以及TNF-α的表达(P＜0.05，P＜0.01)。给予50μg/mL的DHBF的H9c2细胞组，能够提高IL-10的表达(P＜0.05)。 4.与正常组相比较，模型组TLR4蛋白表达水平显著提高(P＜0.05)，MyD88以及NF-κB的蛋白表达水平也显著升高(P＜0.01)。给予不同浓度DHBF的H9c2细胞组，均能够降低TLR4蛋白的表达(P＜0.05，P＜0.01)。给予不同浓度DHBF的H9c2细胞组，均能够降低MyD88蛋白的表达，其中25、50μg/mL的DHBF能够显著降低MyD88蛋白的表达水平(P＜0.05)。给予不同浓度DHBF的H9c2细胞组，均能够降低NF-κB蛋白的表达(P＜0.01)。 5.与正常对照组相比较，H2O2模型组细胞形态损伤明显，线粒体膜电位下降，不同浓度DHBF能够改善细胞损伤，使线粒体膜电位上升。 6.与正常对照组相比较，模型组Caspase-3及Bax的蛋白表达显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，50μg/mL的DHBF能够显著降低Caspase-3及Bax的蛋白表达(P＜0.05)。 结论： 1.DHBF具有良好的体外抗氧化活性。 2.DHBF可以有效抑制LPS诱导的H9c2细胞相关炎症因子与蛋白的表达，其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。 3.DHBF能够抑制H2O2诱导的H9c2细胞凋亡。 提示DHBF可以通过抑制炎症反应以及氧化应激反应保护心肌细胞。
异叶青兰总黄酮;H9c2心肌细胞;体外抗氧化活性;抑制炎症反应
新疆医科大学
硕士
药学
杨淑梅;程路峰
2021
中文
R917
2021-08-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）