CircCREBBP/miR1291/LEFTY2轴在肝纤维化进展中的作用和机制研究
目的：肝纤维化(HF)是持续性肝损伤共有的病理改变，肝纤维化持续发展最终可形成肝硬化，甚至转化成原发性肝细胞癌。但HF临床缺乏早期筛检诊断方法及有效防治手段，阐明肝星状细胞活化增殖的病理生理过程是其防治关键。环状RNA(circular RNA， circRNA)作为一种新型的非编码RNA，CircRNA属非编码RNA，表达稳定特异性高，可作为潜在的诊断标志物与治疗靶点，在多种疾病中发现具有不可忽视的作用并可能成为疾病诊断标志物而被逐渐重视，然而，目前还没有circRNA在肝纤维化疾病中的研究报道。因此本研究拟通过高通量测序技术检测肝纤维患者组织中是否存在circRNA的差异表达，结合生物信息分析以探讨circRNA对可能靶向基因的调控作用及对肝星状细胞活化增殖的调控作用，进而推断在肝纤维化疾病发生发展中的作用及可能机制。 方法：收集17例因肝癌合并肝纤维化的患者肝纤维化组织，随机选择4个样本进行高通量测序筛选，对照组为肝血管瘤患者的肝脏组织11例，随机选择3个样本进行测序，构建circRNAs数据库，对差异表达circRNAs进行GeneOntology(GO )功能分类、富集分析以及KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)分析。选择7个差异表达的circRNAs在13例肝纤维化组织及8例对照组肝血管瘤患者肝脏组织中进行临床验证。利用qRT-PCR和westernblot(WB)检测过表达hsa_circ_0007637对TGF-β1预处理人肝星状细胞细胞系细胞(human Hepatic stellate cells line，LX2 cell)中α-SMA、COL1a的基因和蛋白表达水平的影响；对LX2细胞周期CyclinD1、C-Myc和CDK4表达的影响；以及对microRNA1291和LEFTY2基因和蛋白表达的影响。利用腺病毒小鼠肝脏过表达mmu_circ_0006288，检测miR1291和LEFTY2mRNA和LEFTY2蛋白表达水平。双荧光素酶报告实验检测hsa_circ_0007637与miR-1291以及miR-1291与LEFTY2的靶向关系。利用qRT-PCR、WB及免疫组化在临床样本中检测LEFTY2的表达及过表达LEFTY2对Smad3磷酸化的影响；并验证过表达及阻断miR-1291对α-SMA、COL1a及LEFTY2的影响。 结果：通过高通量测序分析共检测到11136个circRNAs，其中表达存在明显差异103个。与对照组相比，有18个circRNAs在HF组中显著上调，85个在HF组表达量显著下调。GO分析结果提示circRNAs可能与活动在肝脏疾病的生物调节和活性增殖等方面。KEGG分析提示circRNAs可通过参与信号转导、物质运输与分解代谢、介导蛋白水解等通路分子功能方面等，从而影响HF疾病的发生和发展。实时荧光定量PCR(qRT-PCR )技术对对7个差异的circRNAs进行验证，结果符合HF中hsa_circ_0003502的上调，而符合HF中hsa_circ_0072309，hsa_circ_0023919，hsa_circ_0008267，hsa_circ_0007637，hsa_circ_0006117和hsa_circ_0003441的下调。CircCREBBP在肝纤维化组织、小鼠肝纤维化组织或TGF-β1刺激的LX2细胞中均呈低表达。小鼠肝脏过表达mmu_circ_0006288，下调miR1291，上调LEFTY2。LX2细胞过表达hsa_circ_0007637显著下调α-SMA、COL1a的基因和蛋白表达量；对LX2细胞周期CyclinD1、C-Myc和CDK4蛋白表达同样有显著降低作用；对miR1291和LEFTY2的调控作用与小鼠肝脏过表达实验结果一致。双荧光素酶报告实验发现hsa_circ_0007637与miR-1291以及miR-1291与LEFTY2的靶向结合。进一步检测发现miR-1291在肝纤维化组织、小鼠肝纤维化组织或TGF-β1刺激的LX2细胞中均呈高表达。过表达miR-1291可显著增加LX2细胞中α-SMA、COL1a的基因和蛋白的表达水平，并引起LEFTY2显著减少，这一结果阻断miR-1291趋势相反，与过表达hsa_circ_0007637组趋势也相反。通过双荧光素酶报告实验还发现miR-1291能与LEFTY2靶向结合。LEFTY2在HF组表达水平显著低于对照组。过表达LEFTY2可显著减少LX2细胞中α-SMA、COL1a和Smad3的表达，与阻断miR-1291趋势则一致。 结论：本研究首次发现CircCREBBP为保守环状RNA，用VCSCGenomeBrowsers基因等位转换，人肝纤维组织中表达为hsa_circ_0007637，存在于小鼠体内对应的环状RNA为mmu_circ_0006288，已被circBase收录。CircCREBBP在人肝纤维化患者组织、小鼠肝纤维化组织中均显著低表达。过表达hsa_circ_0007637可显著抑制LX2活化增殖指标的表达，并抑制LX2细胞周期进程，使LX2细胞增殖减少。hsa_circ_0007637可能通过吸附miR-1291调节靶基因LEFTY2的表达从而参与肝星状细胞活化增殖过程。靶基因LEFTY2调节肝星状细胞活化及相关TGF-β1/Smad3信号通路，最终形成CircCREBBP调控miR1291/LEFTY2/Smad3轴表达变化-细胞内信号转导-肝星状细胞活化增殖的完整证据链，为临床肝纤维化诊断治疗提供了候选靶点。
肝纤维化;环状RNA;高通量测序;肝星状细胞;TGF-β1/Smad3信号通路
安徽医科大学
博士
药剂学
李俊
2020
中文
R575.2
2021-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）