采后失水对葡萄皮酚类物质的影响及原花青素抑制HepG2细胞转录组分析
采后失水是葡萄加工过程中的一种重要的方式，主要用于高档葡萄汁，葡萄酒以及葡萄天然活性成分的开发利用，目前葡萄采后失水对酚类物质的影响研究较少，其代谢机理尚不清楚。本文基于UHPLC-Q-TOF/MS研究了葡萄采后失水过程中酚类物质、葡萄皮微观结构的变化，并探讨了葡萄采后不同温度失水对花色苷的影响、葡萄原花青素(PCs)对HepG2细胞转录组的影响及通过MAPKs/AKT途径抑制HepG2细胞的生长并诱导细胞凋亡，旨在明确葡萄采后失水过程酚类物质的变化机制及规律，探讨PCs对癌细胞的影响，为葡萄活性成分的开发利用提供依据。 主要研究结果如下： (1)以赤霞珠葡萄为试材，在25℃和45℃条件下进行采后失水处理。各处理组水分含量呈不断下降趋势，45℃失水量显著高于25℃，随失水时间变化失水速率不断下降；葡萄可溶性固形物含量呈上升趋势，45℃处理组显著高于25℃处理组。总酚、总花色苷、单宁、总黄酮含量随着葡萄失水呈现前期上升后期下降的趋势，尤其是45℃处理组的各成分降解速率显著大于25℃处理组。通过电镜观察葡萄表皮细胞结构，新鲜葡萄细胞呈扁平状、膜结构完整、液泡体积较大、叶绿体数量较多、有一定的淀粉颗粒分布、细胞质中染色质分散均匀。随着葡萄不断失水，葡萄表皮细胞发生严重的皱缩、变形、死亡。葡萄失水过程中受到水分胁迫，细胞微结构受损、酚类物质与酶类的区域分隔被破坏，导致酚类物质氧化降解含量不断下降。 (2)葡萄采后失水差异代谢物分析表明，葡萄采后酚类物质受失水温度与失水时间的影响较大。葡萄采后失水主要差异代谢产物PLS-VIP分析表明，25℃失水60%处理与对照组相比，柠檬素显著上调(P＜0.05)；羟基酪醇显著下调(P＜0.05)。45℃失水60%处理与对照组相比，有3种化合物显著上调，分别为：鸢尾黄酮、柠檬素、西伯利亚落叶松黄酮-3-O-葡萄糖苷，有7种化合物显著下调，分别为：4,5,6,7-四甲氧基黄酮、香豆素、苯酚、姜黄素、2,3-二羟基对羟基苯甲酸酯、丁香酸。25℃与45℃失水60%处理组相比，显著上调物质为：鸢尾黄酮(P＜0.05)，显著下调物质为：姜黄素、4,5,6,7-四甲氧基黄酮、香豆素(P＜0.05)。KEGGpathway分析共有7种化合物与4条代谢通路相关，其中与芪类、二芳基庚烷和姜酚生物合成相关的代谢产物为：四羟基芪、白藜芦醇；与类黄酮生物合成相关的代谢产物为：香豆素、槲皮素、表儿茶素；与花色苷生物合成相关的代谢产物为：矢车菊苷；与黄酮和黄酮醇生物合成相关的代谢产物为：槲皮素。研究结果表明，不同温度及失水条件下葡萄采后酚类物质代谢差异显著。 (3)葡萄采后失水温度与失水速率、可溶性固形物含量呈正相关；失水温度与总酚含量呈负相关；花色苷整体不断降解，但咖啡酰化花色苷与聚合花色苷呈上升趋势；较低温度条件下失水有利于花色苷的保存，失水有促使单体花色苷向聚合花色苷转变的趋势，尤其对总花色苷、非酰基花色苷、乙酰基花色苷、香豆酰基影响显著；25℃失水条件下细胞呼吸作用以非酰基化为主体逐渐向酰基化花色苷转化，随着失水的变化聚合花色苷降解；45℃失水条件下，随着失水率的增加，花色苷总体呈现降解趋势，其中乙酰化花色苷、香豆酰化花色苷、非酰基化花色苷降解显著，与其相关性顺序一致。45℃相对25℃花色苷降解差异显著。 (4)通过PCs处理HepG2细胞研究表明：小剂量PCs(50μg/mL)即能诱导HepG2细胞凋亡，与空白对照相比差异极显著(P<0.01)，且PCs对HepG2细胞增殖的抑制作用具有时间和浓度依赖关系。PCs处理HepG2细胞后主要富集到的生物过程为细胞过程、代谢过程、生物调控过程、免疫系统过程、繁殖调节、生长调节，符合原花青素在肝癌细胞上的作用机制。KEGGpathway分析发现细胞凋亡12个关键差异基因与TNF、p53、MAPK、PI3K-Akt、NF-?B信号通路密切相关，葡萄花青素处理HepG2细胞基因差异表达水平研究发现，12个关键差异基因中，上调基因有9个，下调基因有3个。其中与TNF信号通路相关差异基因有9个，与p53信号通路相关的差异基因有2个，与MAPK信号通路相关差异基因有6个，与PI3K-Akt信号通路相关差异基因有2个，与NF-?B信号通路相关差异基因有6个。综上HepG2细胞凋亡与TNF信号通路、p53信号传导途径、PI3K/Akt信号通路、NF-?B信号通路、MAPK信号通路密切相关。 (5)PCs处理HepG2细胞后，从形态观察发现存活的细胞与对照组相比显著减少、细胞呈弥散性分布、并出现凋亡现象、细胞体积肿胀、细胞形状变得不规则。研究表明：PCs能有效抑制HepG2细胞的增殖，引发其凋亡的作用机制是抑制ERK，JNK，AKT和IκBα的磷酸化，促使MAPKs/AKT途径失活，从而使HepG2细胞能量代谢失常，DNA复制受抑制，RNA自动转录停止。
葡萄;酚类物质;原花青素;采后失水;HepG2细胞
新疆农业大学
博士
园艺学
冯作山
2020
中文
S663.1
2021-02-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）