新疆野扁桃PetSBP1基因的克隆及酵母双杂载体构建
新疆野扁桃，属蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物，是世界古老的野生果树，目前，在新疆北疆地区和哈萨克斯坦国境内有少量分布，新疆野扁桃属于配子体自交不亲和类型。本研究通过对新疆野扁桃不同居群花粉特性研究，确定新疆野扁桃花粉活力变化规律及柱头可授性变化范围，进而又克隆获得自交不亲和关键基因SBP1，在此基础上对该基因进行详细的生物信息学分析，并且根据SBP1基因序列构建酵母双杂载体，结果如下： 1.采集新疆野扁桃植株的新鲜花粉，使用新疆野扁桃五个不同自然居群花粉进行实验，采用I2-KI染色法和花粉离体萌法完成新疆野扁桃不同居群的花粉活力日变化及周变化的测定，使用不同浓度，不同配方的花粉培养基配方进行筛选新疆野扁桃最适培养基的组分，实验结果发现新疆野扁桃五个不同居群活力在每日的早10-12时均达到活力最强，在周变化方面新疆野扁桃五个居群花粉活力在开花后第四天达到最大，在花粉最适培养基方面进行花粉培养基不同组分的筛选后发现，新疆野扁桃最佳的花粉培养基配方为琼脂1％、蔗糖10g/100ml、硼酸0.05g/100ml、氯化钙0.009g/100ml。最佳培养温度为25℃，培养时间8h。 2.采集新疆野扁桃花粉进行RNA的提取，并完成SBP1基因的克隆和测序，结果显示新疆野扁桃SBP1基因的全长大小为1211bp，其最大开放阅读框为1017bp，G+C含量为44.43%，A+T含量为55.66%，共编码了338个氨基酸。其编码蛋白的分子式是C1648H2618N470O529S25，理论等电点为5.29，负电荷残基(Asp+Glu)有48个，正电荷残基(Arg+Lys)有36个，脂肪系数73.85，不稳定指数为54.49，平均疏水指数为-0.584，结果显示PetSBP1是一种水溶性不稳定蛋白，且有潜在的磷酸化位点。其编码的氨基酸序列与甜樱桃具有较近的亲缘关系，与马铃薯、拟南芥亲缘关系较远。 3.将获得的新疆野扁桃自交不亲和关键基因SBP1进行并定向克隆到载体pGADT7，获得可用于酵母双杂交的诱饵载体pGADT7-SBP1，将获得的诱导载体进行测序及自激活反应后发现构建的酵母双杂诱饵载体无自激活，转化产物没有毒性，测序结果显示无移码突变及错配现象说明成功构建新疆野扁桃自交不亲和pGADT7-SBP1酵母双杂载体，可用于酵母双杂交系统的后续工作，为进一步从新疆野扁桃自交不亲和cDNA文库中筛选与SBP1互作的蛋白，进而为探究新疆野扁桃的自交不亲和的分子机制奠定了基础。
新疆野扁桃;PetSBP1基因;酵母双杂载体;花粉活力;I2-KI染色法
新疆农业大学
硕士
园艺学
曾斌
2020
中文
S662.9
2021-02-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）