细交链孢菌酮酸开放式夹心免疫分析方法的建立及特性分析
细交链孢菌酮酸(Tenuazonic Acid, TeA)是链格孢霉产生的主要次级代谢产物，分子量为197Da，属于毒性最高的链格孢菌毒素，具有致畸性、致癌性及基因毒性等多种毒性作用。链格孢霉污染农作物、动物食品的范围广、种类多，尤其是在谷物、果蔬及其加工制品中残留水平较高，对人体健康存在潜在危害。然而迄今为止，国内外仍未颁布农产品/食品中链格孢霉毒素残留的相关限量标准，因此加强对其中细交链孢菌酮酸的监测十分必要。开放式夹心免疫分析方法(OpenSandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, OS-ELISA)是基于抗原驱动抗体可变区片段的相互作用增强的原理所建立的一种“非竞争”免疫分析新模式。与常规的竞争免疫分析模式比较，该模式具有更高的灵敏度，特别是对小分子有害物来说，优势突出。因此，本研究以细交链孢菌酮酸为研究对象，在前期获取单链抗体(SingleChainVariableFragment,scFv)的基础上，以其基因为模板，分别扩增重链可变区基因(VariableRegionofHeavyChain, VH)和轻链可变区基因(VariableRegion ofLight Chain,VL)，经大肠杆菌表达、性能分析，制备经分子修饰的抗体重链、轻链可变区蛋白片段，进而建立不同的OS-ELISA分析模式，并对其特性进行研究。主要结果如下： (1)抗TeA抗体可变区片段的表达、纯化及相互作用分析 以实验室前期构建的TeA-scFv表达载体(pET22b-scFv)为模板，设计引物，分别扩增VH和VL基因，构建pET22b-VH、pET22b-VL重组表达载体，转化至E.coliBL21(DE3)pLysS后，挑选阳性克隆，经IPTG、低温(18℃)诱导表达24h。表达产物经Ni-NTAresin填料分离纯化，获得表达量分别为0.5mg/L、2mg/L的VH、VL蛋白片段，纯度可达95%。通过表面等离子体共振生物传感器(Surface Plasmon Resonance, SPR)分析鉴定VH和VL蛋白片段的相互作用，结果表明响应单元(Response Unit, RU)与TeA浓度成正比，说明抗TeA抗体的可变区片段VH和VL可用于OS-ELISA方法的建立。 (2)κ抗体/VL-Cκ/phage-VH细交链孢菌酮酸OS-ELISA方法建立 以表达载体pET22b-scFv为模板，设计引物，分别扩增VH和VL基因，先后插入至噬菌粒载体pDong1/OS，重组载体pDong1/OS-VH-VL转化至E.coliTG1后，挑选阳性克隆，经辅助噬菌体救援，获得展示VH片段的噬菌体(phage-VH)和VL-Cκ表达片段混合物。以Anti-κ抗体的包被浓度为1μg/mL、PBS溶液(0.01 mol/L，pH7.4)为反应缓冲液，建立OS-ELISA方法。结果显示：对TeA的检测限(LOD值)为0.24ng/mL，IC50值为14.7ng/mL，检测范围为1.43-151.18ng/mL。由于存在较高背景值，尝试将可能影响VH与VL相互作用的VH39号谷氨酰胺(Glutamine, Q)定点突变为赖氨酸(Lysine, K)，发现基于VH39K突变体所建立的OS-ELISA方法的背景信号显著降低，灵敏度提高了2倍。 (3)基于phage-VH/麦芽糖结合蛋白-轻链可变区融合蛋白OS-ELISA方法建立设计引物，扩增VL基因，插入至含有麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein, MBP)的表达载体，pMAL-P2E-TEV-VL，重组载体经鉴定转化至E.coliBL21(DE3)pLysS后，挑取阳性克隆，经IPTG诱导表达、Ni-NTAresin分离纯化，获得麦芽糖结合蛋白-轻链可变区融合蛋白(MBP-VL)，表达量为4mg/L，纯度可达90%。进而建立基于phage-VH/MBP-VL的OS-ELISA方法，结果显示：当刚性连接肽(RL)为MBP-VL最佳连接肽、包被浓度为4μg/mL、phage-VH浓度为1010pfu/mL时，LOD值为0.17ng/mL，IC50值为2.60ng/mL，检测范围为0.26-25.90ng/mL，与结果(2)建立的OS-ELISA模式比较，灵敏度提高了3倍。与异细交链孢菌酮酸、链格孢酚等6种真菌毒素的交叉反应率低于1%。添加回收试验结果表明，面粉、果汁、番茄酱等样品的平均加标回收率为87.66%-111.8%，变异系数为1.25%-9.96%。与UPLC-MS/MS结果比较，R2为0.9895，两者具有良好的相关性，提示该方法可用于TeA残留的监测。
细交链孢菌酮酸;抗体可变区基因;开放式夹心免疫分析
华南农业大学
硕士
农产品加工及贮藏工程
王弘
2020
中文
TS207.5
2021-02-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）