动物源MRSA及cfr阳性金黄色葡萄球菌分子特征及传播机制研究
金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜共患条件性致病菌，自畜禽相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(LA-MRSA)出现以来，动物源金黄色葡萄球菌引起人们的广泛关注。动物源金黄色葡萄球菌呈现多重耐药性，其耐药机制复杂多样。本研究调查了我国不同地区猪源和牛奶源金黄色葡萄球菌的分子流行病学特点，运用全基因组测序技术研究重要耐药基因的传播机制，分析了LA-MRSA的遗传进化特征。 本研究在内蒙古、河南和重庆地区采集2548份牛奶样品，分离获得金黄色葡萄球菌768株，包括9株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)；在广东、山东、上海和重庆地区的养殖场、交易市场、屠宰场采集4973份猪源鼻腔拭子样品，分离得到金黄色葡萄球菌302株，包括138株MRSA。采用琼脂稀释法测定分离菌株对16种抗菌药物的敏感性，结果显示猪源金黄色葡萄球菌红霉素的耐药率最高，为97.0%，其次是克林霉素、四环素、泰妙菌素、氨苄西林、复方新诺明、青霉素、沃尼妙林、氟苯尼考和庆大霉素，耐药率分别为94.7%、93.4%、89.7%、88.4%、87.9%、87.4%、86.1%、83.4%和75.2%，对利福平和利奈唑胺的耐药率低，分别为7.0%和0.3%，未发现万古霉素耐药菌株；牛奶源金黄色葡萄球菌的耐药状况相对较好，但仍对氨苄西林和青霉素耐药严重，耐药率分别为82.7%和72.7%。 采用PCR和序列测序的方法对147株动物源MRSA进行spa分型，9株牛奶源MRSA获得6种spa型，分别为t030、t437、t421、t899、t969、t4549；138株猪源MRSA获得13种spa型，以t899为主，其次为t16715、t030、t034、t571、t1939、t4358、t14357、t437、t1775、t2922、t4792、t12076。根据spa分型及MRSA的耐药表型选取49株代表菌株进行MLST分型，分离自河南省的1株牛奶源MRSA为ST9，分离自重庆市的8株牛奶源MRSA有3种ST型，分别为ST239、ST59、ST630；40株猪源MRSA代表菌株的主要ST型为ST9，其次为ST398、ST239和ST59；除1株猪源ST59-t437分离自山东地区，其余ST239和ST59型MRSA均分离自重庆地区，从上海和广东地区各获得2株MRSAST398。运用多重PCR方法进行SCCmec分型，结果显示，8株MRSA-ST239携带SCCmecⅢ，4株MRSA-ST59携带SCCmecⅣa，4株MRSA-ST398和1株MRSA-ST630携带SCCmecⅤ，所有的ST9型MRSA未分型成功。 对1070株金黄色葡萄球菌进行噁唑烷酮类耐药基因cfr和optrA检测，获得7株猪源cfr阳性金黄色葡萄球菌，其中6株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)，1株为MRSA，未检测到optrA基因。采用琼脂(肉汤)稀释法和纸片扩散法对7株cfr阳性金黄色葡萄球菌进行了12类23种抗菌药物的敏感性检测，结果显示，所有菌株均对青霉素、氨苄西林、红霉素、四环素、多西环素、克林霉素、氟苯尼考、泰妙菌素和沃尼妙林耐药，6株MSSA菌株还对庆大霉素、卡那霉素和环丙沙星耐药，河源地区分离的3株金黄色葡萄球菌对替米考星、环丙沙星和复方新诺明耐药。运用WGS技术对7株cfr阳性菌株进行全基因组测序，结果显示，4株ST1-t4792MRSA均携带11种毒力因子基因，除菌株GDM7P549A未携带fexA基因外，均携带9种耐药基因：aph(2'')-Ia、ant(6)-Ia、blaZ、lnu(B)、erm(B)、cfr、fexA、tet(L)和tet(T)，2株ST9-t4358携带11种耐药基因和11种毒力因子基因，1株ST398-t034携带10种耐药基因和5种毒力因子基因。运用测序并拼接后的contiges对cfr基因的遗传背景进行分析，2株MSSA-ST9-t4358中，cfr基因的左右两端为两个方向相同的IS256-like插入序列；4株MSSA-ST1-t4792中，cfr基因的上游为ΔtnpA、istA和istB，下游为ΔtnpB，与转座子Tn558的变异体结构序列一致；在MRSA-ST398-t034菌株中，cfr基因位于完整的Tn558的变异体结构中。 进一步对同时携带cfr和fosD基因的金黄色葡萄球菌(GDC6P036P)进行三代测序，发现cfr和fosD基因位于同一质粒(pGDC6P036P)上，该质粒还携带耐药基因fexA和aadD，质粒pGDC6P036P与Klebsiellaquasipneumoniae携带质粒pL22-3的匹配度高，暗示该质粒能够在不同种属间传播。 为了探究动物源MRSA的遗传进化特征和耐药基因的传播机制，选取部分代表菌株进行全基因组测序。对49株动物源MRSA的全基因组序列进行SNP分析并构建系统发育树，结果显示49株MRSA可分为5个分支，与MLST分型结果一致。应用SCCmecFinder发现所有的ST9MRSA均携带SCCmecXII。筛查MRSA菌株携带的耐药基因和毒力基因，发现所有菌株携带β-内酰胺类耐药基因mecA和blaZ，大部分携带氨基糖苷类耐药基因aac(6')-aph(2'')和大环内酯类耐药基因erm(C)，所有菌株携带毒力因子基因aur、hlb、hlgA、hlgB和hlgC；不同ST型，菌株携带的耐药基因和毒力基因存在显著性差异。分析重要耐药基因的遗传背景发现质粒、SCCmec元件和插入序列等可移动元件在耐药基因的传播中发挥重要作用，基因水平转移是加剧动物源MRSA多重耐药的重要原因。 综上所述，我国动物源金黄色葡萄球菌耐药情况严重，特别是猪源，动物源MRSA的主要流行克隆为ST9，但ST398、ST239和ST59在动物源MRSA中出现，表明我国动物源MRSA来源复杂多样。在动物源金黄色葡萄球菌中发现同时携带cfr和optrA基因的质粒，该质粒的生物学特性有待进一步研究。质粒、SCCmec元件和插入序列等可移动元件介导的耐药基因水平转移加剧我国动物源MRSA的多重耐药。
奶牛;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;cfr阳性金黄色葡萄球菌;分子特征;传播机制
华南农业大学
博士
基础兽医学
曾振灵
2019
中文
S858.23
2021-02-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）