人脐带血浆外泌体的miRNA表达谱分析及冻干制剂制备研究
目的：进行脐带血(human umbilical cord blood, UCB)和成人外周血(adult peripheral blood,PB)血浆外泌体的microRNA(miRNA)表达谱的差异分析，初步分析阐明UCB和PB血浆来源外泌体的生物学功能，以更好地了解UCB血浆来源外泌体的生物学特性，并为基于血液来源的RNA测序提供新的数据；研究UCB血浆来源外泌体冻干制剂的制备方法以及外泌体蛋白含量随储存时间延长的变化，为外泌体制剂的后续研究提供新的参考。 方法：收集10份血液样本(UCB和PB各5例)，采用超速离心法提取血浆外泌体，通过透射电镜(TEM)、纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)、蛋白质免疫印迹法(Western blot)分别鉴定外泌体的形态、粒径和特异性蛋白标志物。采用二代测序技术对人脐带血血浆外泌体(human umbilical cord blood derived exosomes, UE)miRNA和成人外周血血浆外泌体(adult peripheral blood derived exosomes,PE)miRNA进行深度测序；采用碱基识别方法，将测序得到的原始数据文件转化为原始测序序列，从而得到小RNA测序数据集；进行测序数据处理统计和序列比对注释，将注释上的序列进行已知miRNA的统计，将未注释上的序列进行新miRNA的预测；对鉴定的已知miRNA以及新预测的miRNA进行表达量统计；对不同分组间(样本间)筛选出来的差异miRNA进行统计，采用R中的DESeq包进行差异miRNA筛选；通过火山图和表达模式聚类分析热图的绘制，对差异miRNA进行表达分析；通过miRanda、miRDB和TargetScan数据库，对差异表达的外泌体miRNA进行靶基因预测及其GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)功能富集分析，并绘制miRNA-gene与gene-gene之间的互作网络图；通过RT-qPCR进一步检测miR-125a-5p、let-7b-5p、miR-10b-5p、miR-10a-5p、miR-122-5p、miR-127-3p这6个差异表达miRNA(differentially expressed miRNA，DE miRNA)在UE组和PE组中的表达情况，以验证测序结果。采用冷冻干燥技术，使用不同的冻干保护剂(5%甘露醇、5%海藻糖、5%蔗糖、5%山梨醇)对外泌体进行低温冷冻，制备冻干制剂；以未作冻干处理的外泌体为对照，采用BCA法检测各种外泌体冻干制剂的蛋白浓度随保存时间延长的变化，以评估不同冻干保护剂在外泌体冻干制剂制备中的效果。 结果：TEM结果显示，UCB组和PB组外泌体均为散在或聚集的茶托状、直径范围在40-150nm之间的膜性小囊泡；NTA结果显示，UCB组和PB组外泌体的粒径大小与TEM结果相一致，且UCB组和PB组外泌体的粒径分布和颗粒浓度无显著性差异；Westernblot结果显示，UCB组和PB组外泌体均表达CD63、ALIX这2种外泌体特异性蛋白标志物。成功制备了10个样本的小RNA文库；通过测序，共获得321,218,429个rawreads。通过一系列质控，获得了160,627,183个cleanreads；对于每个样品的cleanreads中，有79.81％-85.82％可定位到人类基因组；UE组和PE组可检测到的RNA种类略有不同，其中miRNA是两组中最丰富的小RNA种类。在10个小RNA文库的160,627,183个cleanreads中，有12,564,517个cleanreads与miRbase数据库中的已知miRNA相匹配，对应666个已知的miRNA类别，并预测出186种新miRNA。MiRNA长度分布的数据显示，读取最多的长度为20-24nt，峰值为22nt，表明已知miRNA在测序文库制备过程中得到了很好的富集。聚类分析检查提示，有两个样品(UE3和PE3)与原始组中的其他样品不同，因此后续分析中剔除这2个样品。对剩余的8个样本文库进行鉴定，分别在UE组和PE组中鉴定出了636和613个miRNA。其中，有506个miRNA为UE组和PE组共有。通过比较UE组和PE组的miRNA表达谱，共有65个DEmiRNA，包括46种显著上调的miRNA和19种显著下调的miRNA。这些DEmiRNA的编码基因主要位于19号染色体和14号染色体。其中，有40个DEmiRNA为UE组和PE组共有。通过火山图评估了这些DEmiRNA的总体分布；对65个DEmiRNA的分层聚类分析显示，UE组和PE组之间存在明显区别，表明样本之间的组内相似度高、组间相似度低。共预测到2413个上述DEmiRNA的靶基因；GO富集分析显示，这些DEmiRNA的靶基因在生殖和妊娠(“配体生成”、“胚胎发育”)、细胞移动(“细胞连接”、“细胞黏附”)、神经系统和外泌体的生物合成(“多囊泡体分选途径”、“内体”、“质膜”)等方面发挥重要作用；KEGG信号通路富集分析显示，这些DEmiRNA的靶基因主要参与了与细胞运动、妊娠、癌症和神经系统等有关的信号通路途径。RT-qPCR检测结果表明，除miR-127-3p外，其他被检测miRNA的表达趋势与测序数据一致。与PE组相比，在UE组中，miR-122-5p的表达上调了4.0倍(p＜0.05)。在4个表达下调的miRNA中，let-7b-5p和miR-10b-5p在UE组中的表达水平要显著低于PE组(p＜0.05)，而miR-125a-5p和miR-10a-5p在UE组和PE组中的表达水平无显著性差异(p＞0.05)。成功制备了4种冻干保护剂作用下的外泌体冻干制剂；随着低温保存时间的延长，4种外泌体冻干制剂蛋白含量的下降趋势较未做冻干处理的外泌体样本显著减缓。 结论：通过二代测序，从5份UCB样品和5份PB样品中，共鉴定出666类已知miRNA和186类新miRNA；共筛选出65个差异表达的血浆外泌体miRNA，与PE组相比，UCB血浆来源外泌体中有46个miRNA的表达明显上调，而19个miRNA的表达则明显下调。这些DEmiRNA的靶基因主要参与了与妊娠、癌症、细胞移动和神经系统等有关的信号通路途径，可能在UCB和UCB血浆来源外泌体的特定生物学功能中起关键作用。这项研究为外泌体或基于血液的RNA测序提供了新的数据，有助于更好地了解UCB血浆来源外泌体介导的生理和病理过程。外泌体冻干制剂有望应用于延长外泌体保持蛋白含量的时间。
脐带血;外周血;外泌体miRNA;二代测序;冻干制剂
广东药科大学
硕士
药剂学
袁茵
2020
中文
R329.2
2021-01-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）