COS保护APAP诱导肝损伤药理作用及其注射剂制备的研究
目前，对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)引起的药物性肝损伤是人类肝脏移植第二大原因。在欧美国家50%急性肝衰竭由APAP引起药物性肝损伤所致；在我国APAP引起肝损伤占所有止痛药和抗炎药引发药物性肝损伤的50.8%。因此，迫切需要探索更加安全、有效的治疗APAP诱导肝损伤药物。壳寡糖(Chitosan oligosaccharide，COS)是通过壳聚糖(Chitosan，CTS)水解获得的低聚糖，因其具有分子量小、水溶性好和多种生物活性等特点备受关注。注射液药物具有起效迅速、剂量准确和高生物利用度等优点，将COS制备成注射剂可改善其吸收缓慢和生物利用度低等缺点。本课题通过构建APAP诱导的肝损伤体内和体外模型研究两种特定分子量壳寡糖COST(MW≤1000)和COSM(MW≤3000)保护肝损伤活性与作用机制，在此基础上将其制备成注射剂并进行质量评价。 APAP诱导的肝损伤小鼠通过尾静脉注射给予COST和COSM，结果发现COST和COSM能显著降低小鼠血清ALT和AST含量，呈剂量依赖性，且高剂量效果与阳性药N-乙酰半胱氨酸效果相当。氧化和炎症指标测定结果表明COST和COSM的治疗能显著降低肝脏MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6含量，升高GSH、SOD、GSH-Px和CAT含量和活性。肝脏病理切片结果表明COST和COSM的治疗能减少肝脏坏死细胞数量和炎症浸润。以上结果表明COST和COSM能通过增加肝脏抗氧化能力和减少肝脏炎症浸润保护APAP诱导肝损伤，且COSM的效果优于COST。 取小鼠肝脏组织进行RT-PCR、WB、免疫组化等实验，发现COST和COSM能显著降低肝脏CYP2E1、Keap-1、p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK、Caspase-3和Bax表达，增加Nrf-2、HO-1、eNOS、SOD和Bcl-XL表达，从而减少毒性代谢产物NAPQI生成，增加小鼠肝脏抗氧化能力，并减轻肝脏氧化损伤和细胞凋亡。以上结果表明COST和COSM通过抑制APAP毒性代谢和ASK1/MKK4/JNK通路以及激活Keap-1/Nrf-2通路，从而增加肝脏抗氧化能力和降低肝脏氧化损伤，最终保护APAP诱导的肝损伤；但在作用机制方面COST和COSM的治疗并未表现出明显差异。 在体外通过使用COST和COSM干预APAP诱导L02肝细胞损伤模型实验证明COST和COSM均能显著降低培养基中ALT、AST和肝细胞中MDA含量，显著提高GSH、SOD、GSH-Px和CAT含量或活性，抑制APAP诱导肝细胞损伤。机制研究表明COST和COSM能抑制肝细胞APAP代谢酶CYP2E1表达，激活抗氧化通路Keap-1/Nrf-2/ARE，抑制ASK1/MKK4/JNK通路的激活。细胞实验结果进一步验证体内动物实验结论。 COS含量测定方法学考察表明乙酰丙酮法专属性、精密度、稳定性和重复性良好(RSD小于2%)，加样回收率(98.51%~103.50%，RSD=1.9%)合格，线性关系良好，方法可靠。通过单因素和正交试验得到COST和COSM注射液最佳处方工艺分别为：pH=6.5和7.0，活性炭浓度为0.08%，使用0.22μm滤膜灭菌。测得COST和COSM注射液平均含量分别为96.96%(RSD=0.73%)和94.95%(RSD=1.2%)；COST和COSM注射液外观黄褐色、澄清、无可见异物；装量、pH值、相关物质、溶血与凝聚、异常毒性和脱乙酰度各检查项均符合《中国药典(2015版)》规定。
壳寡糖;对乙酰氨基酚;药物性肝损伤;药理机制
广东药科大学
硕士
药剂学
苏政权
2020
中文
R96
2021-01-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）