抑制Wnt/β-catenin信号通路活性对甲状腺癌干细胞生物学行为的影响
目的探讨沉默CTNNB1从而抑制Wnt/β-catenin通路活性对甲状腺癌干细胞增殖、迁移、侵袭及自我更新能力的影响及相关机制。 方法以免疫磁珠分选技术筛选分离甲状腺未分化癌ARO细胞系中CD133阳性细胞亚群，并采用Western-blot法、CCK-8法、肿瘤细胞球形成实验鉴定其肿瘤干细胞特性。其次将生长状态良好的CD133阳性ARO细胞亚群随机分为空白对照组、阴性对照组和转染组，其中空白组细胞除常规培养外不做任何处理，阴性对照组转染仅携带荧光标记蛋白GFP基因的空载慢病毒，转染组转染携带了靶向沉默CTNNB1基因的shRNA和GFP的重组慢病毒，72h后于倒置荧光显微镜下观察转染效率，选取转染效率大于80%的细胞进行下一步实验。Western-blot法检测三组细胞中目的蛋白β-catenin以及上皮-间质转化标志蛋白E-cadherin、Vimentin表达；CCK-8法检测转染后细胞增殖活性变化；肿瘤细胞球形成实验检验转染后细胞自我更新能力改变；Transwell实验检测转染后细胞增殖和迁移能力。 结果ARO细胞中CD133阳性亚群的Oct-4蛋白相对表达量(0.98±0.01)明显高于CD133阴性亚群(0.59±0.01)，差异具有统计学意义(t=81.04,P＜0.01)；CD133阳性细胞培养4~6天时生长速度明显快于CD133阴性细胞(F=177.18,P＜0.01)，显示CD133阳性细胞具有更强的增殖能力。无血清条件下连续培养1周后，CD133阳性细胞能够形成悬浮生长的肿瘤细胞球，而CD133阴性细胞则不能，说明CD133阳性细胞自我更新能力更强。慢病毒转染72h后倒置荧光显微镜下观察，当感染复数(MOI)约50时，转染效率达80%以上。Western-blot结果显示，β-catenin蛋白在转染组中相对表达量为(0.85±0.02)，明显低于空白组(1.64±0.04)和阴性对照组(1.57±0.05)，差异有统计学意义(F=408.45,P＜0.01)，空白组与阴性对照组无明显差异(P＞0.05)，说明成功构建稳定抑制CTNNB1基因表达的细胞模型。CCK-8结果显示，培养2d、3d转染组与空白组及阴性对照组相比细胞增殖能力下降，差异具有统计学意义(均P＜0.01)，而空白组与阴性对照组细胞OD值差异无统计学意义(P＞0.05)。肿瘤细胞球形成实验结果显示，转染组在细胞球成型率及细胞球体积方面较空白组均呈下降趋势，差异有意义(P＜0.05)。Transwell小室实验结果显示，迁移实验中转染组穿膜细胞数为(94.80±5.11)/视野，明显少于空白组(308.80±12.13)/视野，差异具有显著性(t=-36.339,P＜0.01)。侵袭实验中转染组穿过膜细胞数为(85.00±6.70)/视野，明显少于空白组(267.00±9.08)/视野，差异具有显著性(t=-36.041,P＜0.01)。Western-blot检测上皮表型分子E-cadherin和间质表型分子Vimentin的表达结果提示，间质表型分子Vimentin蛋白在转染组中的相对表达量为(0.85±0.05)，与空白组(1.28±0.04)和阴性对照组(1.27±0.06)相比明显降低(P＜0.01)；上皮表型分子E-cadherin蛋白在转染组中的相对表达量为(1.09±0.08)，较空白组(0.72±0.03)和阴性对照组(0.72±0.02)相比明显升高(P＜0.01)。 结论抑制Wnt/β-catenin信号通路活性可以降低甲状腺癌干细胞增殖、迁移、侵袭及自我更新能力。
甲状腺癌;干细胞;慢病毒;靶向治疗
华北理工大学
硕士
外科学
张国志;田炜
2020
中文
R736.1
2021-01-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）