正十二醇修饰的多西紫杉醇前药纳米结构脂质载体递药系统的初步研究
目的： 为了改善多西紫杉醇(docetaxel，DTX)在临床应用中产生的系统毒性和副作用，本课题设计合成以二硫键为连接臂，正十二醇修饰的DTX前药。以正十二醇修饰的DTX前药为模型药物设计并制备纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carrier，NLC)递药系统，对正十二醇修饰的DTX前药纳米结构脂质载体的制剂学性质，大鼠体内的药动学特征，体外抗肿瘤活性及荷瘤小鼠的药效学效果进行研究，系统评价正十二醇修饰的DTX前药纳米结构脂质载体是否能够提高抗肿瘤效果，为DTX前药的合成和递药系统的选择提供理论依据和试验基础。 方法： 1.正十二醇修饰的多西紫杉醇前药的合成及表征 以3，3’-二硫代二丙酸(-2S3C-)为连接臂，十二醇(Do)为疏水端，采用脱水缩合反应和酯化反应合成含有二硫键的正十二醇修饰的DTX前药(DTX-2S3C-Do)，采用高分辨质谱(HR-MS)和核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定合成产物。 2.正十二醇修饰的多西紫杉醇前药纳米结构脂质载体的制备与质量评价 采用超声法制备正十二醇修饰的DTX前药(DTX-2S3C-Do)的纳米结构脂质载体(D2S3CNlc)，以纳米粒粒径、Zeta电位、包封率和载药量为指标，采用单因素法筛选出较优的处方，再用响应面优化法进行整体优化，通过透射电镜观察纳米粒外观形态，以粒径和多分散指数(PDI)为评价指标考察纳米粒在不同介质中的长期稳定性。 3.正十二醇修饰的多西紫杉醇前药纳米结构脂质载体在大鼠体内的药动学研究 将健康雄性SD大鼠随机分组(n=6)，分别尾静脉注射DTX溶液(DTX-Sol)和D2S3CNlc(12 mg DTX/kg)，于0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24h眼眶取血0.5ml，离心分离血浆。依次加入流动相及内标溶液，涡旋混合后用乙醚提取后离心，取上清液吹干后复溶。以紫杉醇(PTX )作内标建立UPLC-MS/MS分析方法，采用梯度洗脱，MRM监测离子反应DTX：m/z830.1→304.2，PTX：m/z876.5→308.4。测定DTX在大鼠体内的血药浓度，用体表面积法换算得到初始血药浓度C0，梯形法计算AUC0-t。 4.正十二醇修饰的多西紫杉醇前药纳米结构脂质载体的抗肿瘤评价 以DTX-Sol作对照，采用MTT法测定不同浓度、不同孵育时间D2S3CNlc对鼠源乳腺癌细胞(4T1)的抑制率，计算半数抑制浓度(IC50)。于健康雌性balb/c小鼠右侧第四对乳房垫处皮下注射4T1细胞0.2ml(1×106cells/ml)，待肿瘤体积达到100~150mm3时，将小鼠随机分组(n=6)。分别尾静脉注射生理盐水、DTX-Sol及D2S3CNlc(10 mg DTX/kg)，隔天注射一次，共给药5次，记录小鼠体重及肿瘤体积。观察结束后，处死小鼠，解剖分离肿瘤组织并称重，分离小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏器官，做H&E染色。 结果： 1.正十二醇修饰的多西紫杉醇前药的合成及表征 HR-MS结果表明，实测得DTX-2S3C-Do的精确质量数m/z1168.5337([M+H]+，C61H86O17N1S2，0.4ppm)，理论值为m/z1168.5332([M+H]+)。合成产物预测分子式与目标化合物一致，化合物m/z实测值与理论值差值在±3ppm内。1H-NMR结果显示，各共振峰及偶合裂分与正十二醇修饰的DTX前药分子结构中的氢一一对应，说明合成产物与目标化合物一致。 2.正十二醇修饰的多西紫杉醇前药纳米结构脂质载体的制备与质量评价 通过优化得到正十二醇修饰的DTX前药纳米结构脂质载体较优处方工艺：固液脂质比1.43:1，药脂比1:10，乳化剂浓度60mg/ml，温度70?C，搅拌速度800r/min。制得的纳米粒外观圆整，呈均一球形，在水和细胞培养基介质中粒径和PDI在30天内基本保持稳定，但在PBS中稳定性较差。 3.正十二醇修饰的多西紫杉醇前药纳米结构脂质载体在大鼠体内的药动学评价 静脉注射DTX-Sol和D2S3CNlc后，药时曲线下面积(AUC0-∞)分别为1896.87±246.72和5455.22±1677.44ng/ml·h。与DTX-Sol相比，D2S3CNlc的AUC0-∞值明显大于DTX-Sol(p<0.01)，显著增大了DTX在大鼠体内的血药浓度。 4.正十二醇修饰的多西紫杉醇前药纳米结构脂质载体的抗肿瘤评价 DTX-Sol及D2S3CNlc对4T1细胞孵育72h后，求算IC50分别是1.2±0.2和18.0±0.2nmol/L，细胞毒性强弱顺序为DTX-Sol>D2S3CNlc。药效学试验中，第18天时，生理盐水、DTX-Sol和D2S3CNlc组的肿瘤体积分别为1891.04±215.20、1013.64±138.65和596.94±30.30mm3，小鼠体重变化率分别为-19.69±4.44%、-14.85±3.61%、2.63±0.02%。生理盐水和DTX-Sol组肿瘤体积相对较大，且小鼠体重下降明显。相比之下，D2S3CNlc组对肿瘤抑制作用较强，而小鼠体重有微弱增加，说明该纳米结构脂质载体递药系统提高了荷瘤小鼠的生存质量。 结论： 1.成功合成正十二醇修饰的以3，3’-二硫代二丙酸(-2S3C-)为连接臂、十二醇为延长链的DTX前药。 2.制备了正十二醇修饰的DTX前药纳米结构脂质载体，制得的纳米粒粒径均一，符合静脉注射要求，在试验条件下较为稳定。 3.大鼠静脉注射给药后，与DTX-Sol相比，D2S3CNlc明显延长了DTX在大鼠体内的血药浓度的整体水平。 4.体外抗肿瘤试验中，DTX-Sol和D2S3CNlc对4T1细胞的抑制作用均具有时间依赖性和浓度依赖性，且DTX-Sol的细胞毒性强于纳米制剂组。药效试验中，与生理盐水组和DTX-Sol组相比，D2S3CNlc组有较明显的抑制4T1肿瘤生长的效果。而DTX-Sol组小鼠体重明显下降，D2S3CNlc组小鼠体重增大，提高了小鼠的生存质量。
多西紫杉醇;正十二醇;纳米结构脂质载体;药物动力学;细胞毒性;药效学
山西医科大学
硕士
药剂学
张淑秋;任国莲
2020
中文
R979.1
2021-02-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）