基于番茄高效再生体系的柚Cs2、Aco3基因转化体系的建立
Micro-Tom番茄由于生命周期短，体积小，具有较高水平的外源蛋白表达，无表观遗传效应等特点，因此在植物生物技术中具有独特的优势。本试验为了进一步探讨‘琯溪蜜柚’有机酸含量与CmCs2、CmAco3基因的相关性，选用Micro-Tom番茄作为转基因研究的植物材料，通过比较不同外植体类型，改良培养基的成分，设置合适的处置方式，进而建立高效再生体系。通过构建‘琯溪蜜柚’CmCs2、CmAco3基因的载体，并采用农杆菌侵染番茄子叶的方式转化番茄，利用SPSS分析软件进行正交设计，对影响Micro-Tom番茄遗传转化的相关因素进行分析，在此基础上获得转CmCs2、CmAco3基因的转化植株，为验证目的基因的功能提供实验基础。本试验主要研究内容如下： 1、建立了Micro-Tom番茄的高效离体再生体系。通过研究比较不同激素组合对外植体再生发育的影响，外植体类型及处置方式对再生发育的影响，进一步优化再生体系，建立高效的Micro-Tom番茄再生体系。试验结果表明：Micro-Tom番茄种子最优浸泡时间为3h；暗培养最适时间为3d；最适种子培养基为1/2MS培养基；最适苗龄为10d；Micro-Tom番茄子叶的不定芽再生频率高于下胚轴；Micro-Tom番茄子叶在培养基中生长以横切为最佳的切割方式；Micro-Tom番茄不定芽最适激素配比为：2.0mg?L-1ZR和0.5mg?L-1IAA；分别用75%酒精灭菌30s结合8%次氯酸钠灭菌10min的处理组合对种子进行消毒，种子发芽率可达97.78%；转化植株移栽最优基质配比为泥炭土∶珍珠岩∶蛭石=2∶1∶1；加入活性炭能够大幅加快Micro-Tom番茄根的生长速度； 2、建立了Micro-Tom番茄的遗传转化体系。试验以Micro-Tom番茄的高效再生体系为基础，利用正交设计方法设计试验组合，比较分析农杆菌的侵染浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间、OD值以及挑选出最优的抗生素浓度。通过比较外植体对Kan抗性的筛选，调整对比Kan和Tim组合浓度对番茄子叶不定芽再生率的影响，最终建立起最适的Micro-Tom番茄遗传转化体系。试验结果表明经过暗处理预培养3d，利用农杆菌介导CmCs2、CmAco3基因，在OD=0.6时，加入74mM乙酰丁香酮作为农杆菌侵染液，在50r/min震荡下充分接触20min，并且在光暗比16/8h的条件下共培养48h，以此方法进行转化得到的转化效率最高。 3、试验基于前期建立的Micro-Tom番茄高效遗传转化体系利用pBI121质粒构建CmCs2基因和CmAco3基因的表达载体，采用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101，并对Micro-Tom番茄进行pBI121-CmCs2、pBI121-CmAco3基因的遗传转化，对获得的再生苗，通过PCR鉴定其转化基因的遗传稳定性，并测定番茄果实中的有机酸组分、TA、可溶性固形物，基因表达量的变化，在比较野生型Micro-Tom番茄后初步鉴定目的基因的功能，结果发现柠檬酸浓度和贮藏时间呈正相关，而柠檬酸下游的顺乌头酸随着贮藏时间的增加而下降，与柠檬酸浓度呈负相关，因此判断果实中柠檬酸异常积累是由柠檬酸合成加快和降解减慢同时作用的共同结果，并且在基因表达量中发现CmCS2的基因表达量与柠檬酸浓度变化正相关，CmAco3的基因表达量与柠檬酸浓度变化负相关，推测柠檬酸异常积累可能是CS活性增强和ACO活性降低共同作用导致的。CmCS2和CmAco3基因表达量与可滴定酸显著相关，认为CmCS2和CmAco3基因是柠檬酸差异积累的两个关键基因。
番茄;CmCs2基因;CmAco3基因;遗传转化体系
福建农林大学
硕士
园艺学
潘腾飞;潘东明
2020
中文
S641.2
2020-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）