基于自组装纳米粒的新型止血-抗菌双功能涂层的构建及其体内外评价
目的：不可控的出血是战争、事故和灾难中创伤死亡的主要原因。除了创伤导致的不可控出血外，凝血功能障碍也会引起难以控制的大量出血，从而导致死亡。控制出血的同时，伤口感染的预防也不容忽视，感染会严重影响伤口的预后，给创伤护理带来很大的负担。因此，急需一种兼具快速止血和预防感染双重功能的先进止血材料。 课题组前期通过熊去氧胆酸（UDCA）介导的聚乙烯亚胺（PEI）的自组装制备了PEI/UDCA纳米粒，该纳米粒可以通过库仑力诱导血小板的激活聚集，促进凝块形成，并在一系列动物出血模型中取得了出色的止血效果。基于此，并针对上述问题，本课题期望通过构建一种通用型止血-抗菌双功能涂层来实现快速止血和抗菌的双重目标。为完成这一设想，利用层层自组装策略，通过多巴胺或鞣酸（TA）在碱性条件下的氧化自聚以及PEI/UDCA纳米粒（PUNPs）的静电吸附，分别构建了负电性的粘附层和PUNPs功能层，得到了聚合多巴胺-纳米粒（PDANPs）或鞣酸-纳米粒（TANPs）涂层。由于多巴胺和TA可以粘附在不同材料表面，因此PDANPs和TANPs涂层具有通用性。本课题考察了PDANPs和TANPs涂层体外诱导血小板激活聚集和杀灭细菌的能力，并将PDANPs和TANPs涂层分别涂布于26G注射器针头表面，在健康大鼠和血小板减低症大鼠的静脉穿刺出血模型中评价了其止血效果。 方法：1.PUNPs的制备与表征 采用透析法制备PUNPs纳米粒（UDCA和PEI的质量比为2∶1）。通过透射电子显微镜（TEM）观察形态，动态光散射粒度仪（DLS）测定粒径和Zeta电位。 2.PDANPs和TANPs涂层止血针的制备与表征 采用浸入式层层自组装的涂层方法，26G注射器针头先后竖直浸入多巴胺溶液（pH8.5）和PUNPs分散液或鞣酸溶液（pH7.8）和PUNPs分散液中，分别得到PDANPs涂层止血针和TANPs涂层止血针。利用扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱仪（EDS）和活体成像（IVIS）等手段确定涂层成功涂布于针头表面。 3.PDANPs和TANPs涂层对血小板激活聚集的影响 采用Landsbergs法分离大鼠的富血小板血浆（PRP）。用FITC-anti-CD61抗体特异性标记血小板，采用激光共聚焦延时拍摄的方法，观察血小板接触PDANPs和TANPs涂层后动态的聚集过程；通过激光共聚焦显微镜（CLSM）观察涂层表面的血小板聚集体与PUNPs的共定位情况。FITC-anti-CD61抗体标记全部血小板，PE-anti-CD62P抗体标记活化血小板，CLSM观察与涂层共孵育的血小板的激活情况。涂层与PRP共孵育后固定、梯度脱水、喷金，SEM观察涂层表面血小板的聚集情况和形态变化。 4.PDANPs和TANPs涂层体外促凝块形成特性研究 枸橼酸钠抗凝全血和血小板减低症全血分别与两种涂层共孵育后，固定、梯度脱水、喷金，SEM观察涂层表面的凝块形成情况。 5.PDANPs和TANPs涂层止血针在健康啮齿动物中的促凝效果评价 分别在正常大鼠股静脉穿刺实验、大鼠隐静脉贯穿实验及小鼠尾静脉穿刺实验中考察止血针对静脉穿刺/穿透出血的止血效果。通过SEM观察股静脉针孔处凝块的形态以及使用过的针头表面血小板的激活聚集情况。通过IVIS和股静脉穿刺局部切片观察PDANPs-Cy5和TANPs-Cy5针头穿刺部位的荧光残留情况。 6.PDANPs和TANPs涂层止血针对血小板减低症大鼠凝血的影响 分别在血小板减低症大鼠股静脉穿刺实验和隐静脉贯穿实验中比较止血针组和普通针头组出血量和出血时间的差异，考察在血小板数量减少的情况下PDANPs和TANPs涂层的促凝效果。 7.PDANPs和TANPs涂层的抗菌效果评价 采用菌落计数法和细菌死活染色法考察PDANPs和TANPs涂层对金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌细菌活力的影响。通过SEM观察与涂层共孵育的金葡菌和鲍曼菌的形态改变。 8.PDANPs和TANPs涂层止血针的生物安全性评价 分别用空白针头、PDA、PDANPs、TA和TANPs针头穿刺大鼠股静脉，止血后缝合，正常饲养14天后处死，比较各组体重增长情况、脏器指数、血常规、生化指标和凝血功能的差异及主要脏器H&E切片的病理情况。 结果：1.通过透析自组装法制备了形态规整、粒径均一的PUNPs纳米粒，粒径为209±2nm，Zeta电位为67.3±0.6mV。通过扫描电镜和IVIS观察以及EDS元素分析，均发现PUNPs存在于PDANPs和TANPs针头表面，说明利用层层自组装策略成功地将PUNPs富集在针头表面。 2.共聚焦延时拍摄和共定位观察发现PDANPs和TANPs涂层可以诱导血小板大量聚集，涂层上粘附的血小板聚集体与PUNPs存在良好的共定位，而且90%以上的血小板被激活，高表达P-选择素。通过SEM也观察到涂层诱导的血小板聚集以及血小板激活后形态的改变。进一步，通过SEM观察发现，涂层可以促进枸橼酸钠抗凝全血和血小板减低症全血凝固，涂层表面形成了大量凝块，甚至部分凝块具有纤维蛋白网络。 3.在健康大鼠股静脉穿刺实验、隐静脉贯穿实验和小鼠尾静脉穿刺实验中，与空白针头相比，PDANPs和TANPs涂层止血针可以明显缩短出血时间，减少出血量，加速凝血进程。使用过的PDANPs和TANPs涂层止血针表面可以观察到血小板大量聚集并且形态发生改变。通过活体成像和激光共聚焦观察发现，在穿刺过程中，涂层上的PUNPs会残留在穿刺部位。 4.在白消安诱导的血小板减低症大鼠的股静脉穿刺实验和隐静脉贯穿实验中，与空白针头相比，PDANPs和TANPs涂层止血针仍然可以显著缩短出血时间，减少出血量，加速凝血进程。 5.在体外抗菌实验中，经菌落计数和细菌死活染色检测发现，与PDANPs和TANPs涂层共孵育的菌液以及涂层上粘附的细菌中均无细菌存活。通过SEM观察也发现涂层表面的细菌形态干瘪，细胞壁损坏，内容物膨出，大部分无活细菌形态。 6.PDANPs和TANPs涂层止血针穿刺后的大鼠体重增长正常，脏器指数、血常规、生化指标和凝血功能与对照组相比无明显差异，主要器官H&E切片未观察到病理改变。 结论：1.本课题利用多巴胺和TA在碱性条件下氧化自聚的特性以及PDA和TA涂层与PUNPs之间的静电力，分别构建了PDANPs和TANPs涂层，并将其成功涂布于26G注射器针头表面。 2.PDANPs和TANPs涂层通过涂层上的PUNPs诱导血小板激活、聚集，进而促进凝块形成，加速凝血过程。在血小板数量减少的情况下，PDANPs和TANPs涂层依旧可以促进血液凝固。 3.PDANPs和TANPs涂层通过涂层上的PUNPs破坏细菌细胞壁，发挥抗菌作用，对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有良好的抗菌活性。 4.在健康大鼠和血小板减低症大鼠的静脉穿刺出血模型中，PDANPs和TANPs涂层止血针表现出出色止血效果，甚至实现不出血。体内生物安全性评价表明，PDANPs和TANPs涂层止血针对机体无明显不良影响。
多巴胺-纳米粒;鞣酸-纳米粒;自组装法;止血功能;抗菌活性;聚合多巴胺
陆军军医大学
硕士
药剂学
张建祥
2020
中文
R318.08
2020-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）