活性氧响应多功能纳米粒口服抑制动脉粥样硬化的体内外研究
目的：动脉粥样硬化（AS）是造成冠心病、中风、外周血管疾病的主要原因。目前临床用于AS防治药物的疗效十分有限，且存在诸多不良反应。氧化应激是动脉粥样硬化的主要致病因素之一，然而不管是传统的食疗法还是以普罗布考为代表的小分子抗氧剂均未给动脉粥样硬化的防治带来积极作用。因此，探索新型抗氧化策略成为基于氧化应激防治AS的关键。课题组前期以（β-Cyclodextrin,β-CD）为骨架分子，合成了具有活性氧（ROS）响应性和清除性材料TPCD，其纳米粒TPCD NP在足趾肿胀、急性腹膜炎、急性肺损伤等急性炎症模型中呈现良好的疗效，且静脉注射TPCD NP能在小鼠模型中有效防治中性粒哮喘和AS等慢性炎性疾病。因此，本课题一方面拟研究口服TPCD NP是否具有抗AS作用以及潜在治疗机制；另一方面拟以其为ROS响应性功能纳米载体，负载抗炎药物Darapladib（DA），制备一种ROS响应性多功能纳米药物TPCD-DA NP，评价其口服防治AS的效果和安全性。 方法：1.TPCD的合成及表征 将Tempol和4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯（PBAP）共价链接在β-CD上，合成ROS响应性和清除性材料TPCD。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（1H NMR）、基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF）对TPCD进行结构和分子量的确证。 2.TPCD NP和TPCD-DA NP的制备与表征 将磷脂酰胺聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）和卵磷脂分散在水相中，溶于甲醇中的TPCD作为油相，室温剧烈搅拌下将油相逐滴滴加在水相中，得到TPCD NP；另外将Darapladib和TPCD共同溶于甲醇作为油相，得到TPCD-DA NP。通过马尔文激光粒度仪（DLS）测定纳米粒的大小和Zeta电位，透射电子显微镜（TEM）观察纳米粒的形貌。 3.TPCD NP和TPCD-DA NP活性氧响应性水解研究 将TPCD NP和TPCD-DA NP分别与1mM H2O2和PBS共孵育，在预设的时间点观察两种纳米粒的水解情况。另外，利用高效液相色谱仪测定TPCD-DA NP的载药量、包封率以及在H2O2中的累积释放曲线。 4.TPCD NP抑制细胞内活性氧的产生和H2O2诱导的细胞凋亡 TPCD NP与RAW264.7细胞预先孵育后，PMA处理4h。选用DCFH-DA活性氧探针考察TPCD NP对细胞内活性氧产生的影响；另用200μM H2O2处理8h，评价TPCD NP对高浓度H2O2所致的细胞凋亡的抑制作用。 5.TPCD NP和TPCD-DA NP延缓活性氧诱导的细胞衰老和抑制细胞炎症因子的分泌 在RAW264.7和Caco-2细胞上结合β-半乳糖苷酶染色染色试剂盒评价纳米粒对H2O2诱导的细胞衰老的影响；另外，通过ELISA检测两种纳米粒对RAW264.7细胞分泌MCP-1、TNF-α以及IL-1β的影响。 6.TPCD NP体内抗AS效果评价 6-8周龄的ApoE-/-小鼠随机分成2组，分别为模型组（高脂饮食）、空白纳米粒组（25mg/kg TPCD NP），高脂喂养一个月后开始口服给药，每4天一次，连续给药11周。给药结束后收集样本，主动脉油红染色评价TPCD NP对AS斑块面积的影响。 7.TPCD NP治疗AS的机制研究 6-8周龄的ApoE-/-小鼠随机分成2大组，一大组分别为普通饲料饮食组、高脂饲料饮食组；另一大组分别为高脂饮食组、高脂饮食同时口服TPCD NP组（25mg/kg TPCD NP），高脂饮食一个月后开始口服给药，每4天给药一次，连续给药11周。 给药结束后收集各组小鼠粪便样本，运用16S rRNA基因测序技术检测微生物种群和含量。 8.TPCD-DA NP体内抗AS效果评价 6-8周龄的ApoE-/-小鼠随机分成4组，分别为模型组（生理盐水）、游离药物组（20mg/kg Darapladib）、空白纳米粒组（62.5mg/kg TPCD NP）、载药纳米粒组（10mg/kg TPCD-DA NP，对应TPCD NP剂量为62.5mg/kg）。高脂饲料喂养2个月后开始口服给药，每4天一次，连续给药7周。 给药结束后收集样本，主动脉油红染色评价不同给药组AS斑块面积的大小；主动脉根部免疫组化染色考察斑块的稳定性、巨噬细胞的含量；检测血清中LP-PLA2的含量以及肠中段、肠下段、结肠匀浆液中炎症因子的含量。 9.TPCD NP和TPCD-DA NP体内初步安全性评价 动物分组给药方案同体内抗AS效果评价实验。给药结束后收集血样，检测两种纳米粒对血常规、肝功、肾功和血脂有无影响，主要脏器HE染色观察TPCD NP和TPCD-DA NP对其有无影响。 结果：1.Tpl和PBAP分子通过共价键结合在β-CD骨架上，成功合成了具有ROS响应性材料TPCD。另外，通过纳米沉淀/自组装法成功制备TPCD NP和TPCD-DA NP，电镜观察其为球形形态，且纳米粒在1mM H2O2中能够响应性水解，在PBS中的能够稳定存在。 2.高效液相色谱（HPLC）检测TPCD-DA NP的载药量为16%，包封率为85%；在1mM H2O2中5h时药物累积释放率为82%，12h时药物累积释放率为96%，几乎释放完全。 3.体外细胞实验结果表明，TPCD NP能显著抑制RAW264.7胞内活性氧的产生，且具有剂量依赖性；TPCD NP亦能显著抑制高浓度H2O2诱导的细胞凋亡。 4.TPCD NP和TPCD-DA NP能抑制过氧化氢导致的RAW264.7细胞和Caco-2细胞的衰老；ELISA检测细胞培养上清中MCP-1、TNF-α和IL-1β的含量，结果表明TPCD NP和TPCD-DA NP能显著降低细胞中炎症因子的分泌，且TPCD-DA NP干预组具有最佳疗效。 5.体内疗效评价实验结果表明，TPCD NP和TPCD-DA NP干预都能显著降低ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块面积，但是TPCD-DA NP效果更优；且TPCD-DA NP治疗组小鼠主动脉根部巨噬细胞的含量更低、斑块稳定性更佳。 6.ApoE-/-小鼠肠道菌群检测结果表明，高脂饮食会改变肠道菌群的组成，降低肠道菌群的丰度；TPCD NP干预后能逆转因高脂饮食导致的肠道菌群丰度的降低。 7.体内安全性评价实验结果表明，口服TPCD NP和TPCD-DA NP后，小鼠的体重、血常规、肝功、肾功、血脂水平与模型组小鼠相比并无显著差异，主要脏器HE染色结果表明口服纳米粒后亦不会对脏器产生病理性改变。 结论：1.本课题基于ROS响应性载体材料TPCD，选择负载抗炎药物Darapladib，通过纳米沉淀/自组装法成功构建了两种纳米粒TPCD NP和TPCD-DA NP。 2.体外细胞实验证明上述纳米粒具有抗炎和抗凋亡的作用，且能有效抑制胞内活性氧的水平和氧化应激所致的细胞衰老。 3.在体内抗AS效果评价实验中，口服TPCD NP和TPCD-DA NP均能显著抑制主动脉斑块面积，且TPCD-DA NP干预组治疗效果更佳，具有协同作用。此外，TPCD NP能够改善因高脂饮食所致的肠道菌群丰度降低，达到降低主动脉斑块面积的效果，实现对AS发展进程的调控。 4.体内初步安全性评价结果表明，TPCD NP和TPCD-DA NP可作为一类相对安全的口服治疗AS的纳米药物。 综上所述，本课题一方面研究证明了口服TPCD NP对AS具有良好的防治作用，且可能是通过改善肠道菌群丰度来调控AS的进程。另一方面通过结合抗炎药物Darapladib和ROS响应性材料TPCD，制备了一种安全且具有协同作用的口服纳米药物TPCD-DA NP，有望应用于AS等相关疾病治疗。
药物载体;纳米粒;动脉粥样硬化;活性氧响应性
陆军军医大学
硕士
药剂学
张建祥
2020
中文
R318.08
2020-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）