基于 DNA/RNA杂交的农产品中有机磷农药残留生物条形码免疫分析方法研究
我国是农业大国，农产品质量与安全是保障国民健康和经济社会发展的前提。农药在防治虫害，调节农作物生长方面起着重要的作用，但是盲目使用农药会造成农药残留超标等问题，对人类健康和生态环境造成不可逆转的危害。因此急需建立一种灵敏度高、准确性好、可重复性强、操作性简便的检测方法来满足现阶段有机磷农药残留检测的需求，这对社会的发展、国民的健康具有重要意义。 本研究是在生物条形码免疫分析方法的基础上，结合DNA/RNA杂交循环技术和核糖核酸酶H（RNase H）的特异性水解作用，实现对农产品中有机磷农药残留的检测分析研究。由于农药小分子只有一个结合位点，传统的“三明治”夹心免疫法无法实现对小分子的检测，所以实验采用间接竞争的方法实现对农药小分子残留的定性和定量检测，检测过程分为免疫反应阶段和杂交水解反应，将检测到的荧光信号间接转换为农药残留的浓度。研究的主要内容如下： 将三唑磷农药单克隆抗体和DNA单链标记在胶体金纳米颗粒表面，制备胶体金纳米探针，并进行表征。首先对免疫反应的实验条件进行探索，对使用的磷酸盐缓冲液工作浓度和pH值、探针和OVA-半抗原的稀释倍数、甲醇的浓度进行优化；然后对杂交水解反应的实验条件进行探索，对其反应添加的二硫苏糖醇（DTT）浓度、离子强度、pH值、Mg2+浓度和反应的温度条件进行优化。在探索出来的最优反应条件下建立基于DNA/RNA杂交的三唑磷农药生物条形码免疫分析方法的标准曲线，得到该方法的检测范围为0.01～100ng/mL，最低检出限为0.0032ng/mL。将该方法应用到实际样品的检测中，发现将样品提取液稀释20倍时，其基质效应的影响可以忽略不计。对水样品和4种农产品进行三唑磷农药的添加回收实验，得出该方法的平均添加回收率为73.4%～116%，变异系数为7.04%～17.4%，将建立的方法和LC-MS/MS方法进行线性拟合，表现出很好的相关性，说明该方法具有良好的准确性和可靠性，满足实际样品中三唑磷农药残留检测分析需求。 在单残留的检测基础上，建立了基于DNA/RNA杂交的生物条形码同时检测三种有机磷农药的多残留免疫分析技术。在制备对硫磷、毒死蜱的胶体金探针时，优化了农药单克隆抗体的用量。探究了多残留体系中RNA链上标记的荧光基团的交叉反应，发现FAM、Cy3、Cy5三种荧光基团信号强度高且互相影响较小，可以将这三种荧光标记物质用于有机磷农药多残留检测。探究了三种胶体金探针、OVA-半抗原和荧光标记的RNA链之间的特异性，发现互相之间特异性良好，该方法在有机磷农药多残留检测方面具有可行性。优化了三种OVA-半抗原和胶体金探针的稀释倍数。在最优条件下建立该方法同时检测三种有机磷农药的多残留标准曲线，得到三唑磷、对硫磷、毒死蜱的检测范围分别为0.01~100ng/mL、0.05～100ng/mL和0.1～500ng/mL，最低检测限分别为2.42×10-2ng/mL、8.19×10-3ng/mL和7.62×10-2ng/mL。在5种农产品中进行添加回收实验，得到平均添加回收率为83.7%～103.5%，CV值为7.71%～16.9%，与LC-MS/MS仪器方法的结果具有一致性。以上结果表明该方法准确性高，可用于农产品中农药残留检测，也为该方法检测其他小分子物质奠定理论基础。
有机磷农药;残留检测;生物条形码;免疫分析法;DNA/RNA杂交技术;胶体金探针;核糖核酸酶H;特异性水解
烟台大学
硕士
农产品加工及贮藏工程
贺红军;金茂俊
2020
中文
S481.8
2020-12-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）