杨树不定根调控基因的筛选与功能鉴定
杨树是我国主要的人工林树种之一，扦插繁殖是其主要的育苗和造林手段。而插穗不定根的形成与发育是影响扦插成功的关键因素，也是包括杨树在内的大多数木本植物无性繁殖和工厂化育苗的限制因素。本研究通过在杨树中构建所挖掘基因的超表达转基因突变体(OE)，对突变体进行不定根相关性状的鉴定。鉴定结果显示有2个基因表现出增强了AR发育的能力，基因分别命名为WZ4(一种CML蛋白)和XZ6(一种NAC转录因子)。对WZ4-OE转基因株系进行了精细地鉴定。主要研究进展如下： 1、通过对在WPM培养基中培养的南林895杨(P.deltoids×P.euramericana)组培苗不定根生根动态观测，以及制作南林895杨组培苗茎段基部的石蜡切片，统计插穗扦插至WPM后第0-8天5个时间点上不定根原基的发生率，确定了杨树不定根形成的主要时间节点。提取相应时间点的杨树插条基部RNA，进行转录组学分析，按照一定的阈值和筛选方案，从中挑选出6个可能参与杨树不定根形成与发育的候选基因，这些基因对应毛果杨参考基因组编号为Potri.017G126200、Potri.002G065600、Potri.014G103000、Potri.004G042600、Potri.004G033100、Potri.001G404100。为了方便记录，对其重新命名为：WZ4、XZ2、XZ3、XZ4、XZ5、XZ6。克隆筛选出的候选基因并构建GFP融合表达载体，在烟草表皮细胞中开展亚细胞定位，发现这些候选基因中的转录因子蛋白均定位在细胞核中，说明这6个基因可能都具有转录因子的功能。同时WZ4基因的融合蛋白也定位在细胞膜上，说明WZ4基因的表达产物可能不仅作为转录因子，还可能作为结构蛋白参与细胞膜上的活动。 2、对以上6个候选基因构建超表达载体，通过根癌农杆菌介导法和叶盘转化法将载体转入南林895杨中。对上述转基因材料进行DNA、RNA和蛋白质3个水平阳性鉴定，获得阳性转基因株系，并对阳性株系进行扩增繁殖获得足够数量的单株。 3、以野生型南林895杨作为对照，先在组培条件下观察比较各阳性株系的不定根性状，有明显差异的转基因株系再置于水培条件和土培条件下进行更准确的鉴定。目前已发现WZ4基因的转基因株系在3个不同条件下，不定根的长度均显著高于野生型。基于这一结果，本研究对WZ4基因进行了更细致的功能分析。 4、通过对WZ4基因的序列进行同源分析，初步推断WZ4为钙调素类似蛋白调控基因(CML23-1)。同时组织特异性表达分析结果显示，WZ4基因在不定根组织中的表达量最高并显著高于茎、叶柄和顶芽组织，说明WZ4基因在杨树中发挥作用的主要部位是不定根组织。对WZ4超表达转基因株系进行转录组学分析，发现一批调控基因的表达显著提高了，其中功能注释为过氧化氢合成酶的基因Potri.001G011300表现出最高水平上调表达，推测WZ4基因可能间接参与调控过氧化氢合成从而调控了不定根的发育。 5、克隆WZ4基因的启动子序列，分别构建酵母单杂载体和连接GUS表达载体(分析基因表达组织特异性的载体)。构建的酵母单杂载体转化酵母菌株Y1H-Gold，接种于含有抗生素AbA的酵母缺陷型培养基上，结果显示在高浓度AbA环境中转化了WZ4启动子的Y1H酵母菌株依旧可以正常生长，说明WZ4酵母菌株出现自激活现象。对连接GUS表达载体转化杨树获得的阳性转基因植株进行GUS化学组织染色，发现叶片、根尖和茎尖处被染成蓝色，与组织特异性表达分析结果基本一致。 通过本研究的开展，我们成功获得了一批参与杨树不定根形成和发育调控的候选基因，并对其中部分基因进行了不定根性状的鉴定以及对WZ4基因的功能进行了一定的系统性研究。基于本研究，我们加深了对杨树不定根性状的了解，并获得了一批与杨树不定根相关的基因资源和一个具有改良杨树不定根发育潜力的基因，为创造新的良种资源奠定了重要的理论基础和基因资源。
杨树;基因筛选;遗传转化;功能鉴定
华中农业大学
硕士
林木遗传育种
汪念
2020
中文
S792.11
2020-12-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）