酸性磷酸酶OsACP1在水稻缺磷适应性中的功能研究
磷是植物生长发育所必需的大量元素之一，不仅参与组成DNA、RNA和磷脂等植物中多种重要的大分子有机物，也在植物的光合作用、呼吸作用和能量代谢等基础生理代谢过程中起十分重要的作用。植物只能直接吸收利用可溶性无机磷(Pi)，但土壤中大部分磷素以有机磷或固定态无机磷的形式存在，因此土壤中的有效磷往往不能满足植物的生长发育需要。为了应对土壤有效磷缺乏，植物进化出了一系列低磷适应性反应来维持自身的正常生长，包括改变根系构型、形成菌根共生体、诱导高亲和磷酸盐转运体、诱导分泌有机酸和酸性磷酸酶等多种生物学途径，从而增加磷的吸收与利用，以维持体内磷稳态。其中植物受缺磷诱导的酸性磷酸酶不仅增加了土壤中能被植物吸收的无机磷含量，而且能够加强植物内部磷素的循环再利用。 通过对水稻转录组数据分析，前期研究中我们发现酸性磷酸酶OsACP1显著受缺磷和OsPHR2的诱导表达，说明该基因可能参与水稻的缺磷适应性反应。根据生物信息学分析，证实OsACP1属于卤酸脱卤素酶(haloacid dehalogenases，HAD)超家族成员，在不同作物中存在多个同源基因，目前对这些同源基因的研究发现，多个成员受缺磷诱导表达并参与调控作为的缺磷适应性反应，但是其中的分子机制还不清楚。为了研究OsACP1的生理生化功能，我们首先分析了OsACP1基因的时空特异性表达。RT-PCR分析证实OsACP1特异性受缺磷诱导表达，而对其它营养缺乏条件没有显著反应。进一步利用实时定量PCR和OsACP1启动子::GUS转基因材料分析发现OsACP1在地上部分和地下部分均显著受缺磷诱导表达。 为了研究OsACP1的酶活特性，我们利用无缝克隆技术构建了OsACP1的原核表达载体，并通过原核表达系统纯化了OsACP1蛋白。酶学活性和底物特异性测定结果表明，OsACP1蛋白的最适pH为6.0，辅酶离子为镁离子，对不同的有机磷底物均表现出活性，其中对磷酸乙醇胺的活性最高。进一步利用水稻原生质体转化系统确定OsACP1蛋白的亚细胞定位，我们发现OsACP1-GFP融合蛋白主要定位于水稻细胞中的内质网膜以及高尔基体膜上。 为了解析OsACP1在水稻缺磷适应性中的功能，我们克隆了该目的基因，并通过农杆菌介导的转基因技术创制了OsACP1的超表达和CRISPR突变体材料。将超表达OsACP1基因的水稻进行正常和缺磷处理培养发现，与野生型相比，正常磷供给条件下，水稻超表达材料植株生长受到显著抑制，但是磷含量显著升高，在10d大小幼苗的第一片叶尖出现磷中毒表型，缺磷处理条件下，该叶尖磷中毒表型消失。因此，说明超表达OsACP1会影响水稻正常生长条件下细胞内的磷平衡，继而影响其生长。在正常和缺磷条件下，与野生型相比，突变体生长表型也受到抑制，但是其叶片磷含量没有显著变化。田间农艺性状分析进一步证实，OsACP1的超表达和突变体生长均受到显著抑制。 综上所述，本课题利用分子生物学、生理学和生物化学等一系列技术手段，分析了水稻OsACP1基因的生理生化功能，初步证明了OsACP1可能参与缺磷条件下内质网和高尔基体膜磷脂的重构，通过代谢磷酸乙醇胺和磷酸胆碱等有机磷，维持缺磷条件下水稻细胞内的磷稳态。
水稻;酸性磷酸酶OsACP1;缺磷诱导
华中农业大学
硕士
植物营养学
王创
2020
中文
S511
2020-12-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）