艾地普林--磺胺甲噁唑复方注射液对副猪嗜血杆菌的PK--PD同步模型研究
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是一种猪上呼吸道条件致病菌，感染后以浆液性纤维素性胸膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。该病的爆发给养猪业带来巨大的经济损失，并且近些年副猪嗜血杆菌对许多抗菌药产生多重耐药性，因此寻找一种安全有效的抗菌药治疗副猪嗜血杆菌病很有必要。 艾地普林(Aditoprim，ADP)是一种新型的动物专用抗菌增效剂，其不仅生物利用度高且在体内分布广泛。前期药效学研究显示其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有作用，与其同类药物甲氧苄啶(Trimethoprim，TMP)相比，ADP抗菌能力远远强于TMP。磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole，SMZ)属于全身应用的中效磺胺类药，是临床上广泛应用的广谱抗生素，常用于水产类及畜禽类动物疾病的治疗。SMZ在体内吸收迅速，很快在血浆和肺组织中达到较高浓度。但在近些年来研究中，磺胺类药物对一些呼吸道和消化道病原菌耐药率逐年增加。研究发现两药联合使用，其抗菌能力远远强于单独使用，两者联用在减少单药用量的同时降低了耐药率，具有很好的发展前景。 本课题通过ADP和SMZ单方以及ADP-SMZ复方的药效学研究，发现单方的抗菌效果显著低于复方的抗菌效果。因此建立ADP-SMZ复方注射液对副猪嗜血杆菌感染的药动学-药效学(Pharmacokinetic-Pharmacodynamic modeling， PK-PD)同步关系，并以此确定了ADP-SMZ复方注射剂临床合理的给药方案。 1艾地普林、磺胺甲噁唑及艾地普林-磺胺甲噁唑复方的药效学研究 参考美国临床实验室标准化协会CLSI推荐的琼脂稀释法测定了ADP、SMZ以及ADP-SMZ复方对104株菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)，得到ADP、SMZ以及ADP-SMZ复方对副猪嗜血杆菌的MIC50分别为128μg/mL，>512μg/mL和32/640μg/mL。选择较敏感的13株进行肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)分型试验，筛选出5型菌株，并且同时进行小鼠毒力试验，首先选用16g~20g健康Balb/c小鼠120只，进行分组每组3只，腹腔注射0.3mL1×109CFU、1×108CFU、1×107CFU菌液，观察小鼠病变情况及死亡情况，筛选出致病性最强的菌株，最终选择毒性最强且血清5型菌株H78来进行接下来的PK-PD实验。 参考CLSI推荐的微量肉汤稀释法，测定ADP、SMZ及ADP-SMZ复方对致病性副猪嗜血杆菌H78在肉汤和肺泡灌洗液(Pulmonary Epithelial Lining Fuid，PELF)中MIC和最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration， MBC)结果显示ADP在肉汤和肺泡灌洗液中的MIC分别为4μg/mL和2μg/mL，MBC分别为8μg/mL和4μg/mL；SMZ在肉汤中的MIC为512μg/mL和，MBC为1024μg/mL；ADP-SMZ复方在肉汤和肺泡灌洗液中的MIC分别为2/10μg/mL和0.5/2.5μg/mL，MBC分别为4/20μg/mL和1/5μg/mL，可以看出ADP及ADP-SMZ复方在肺泡灌洗液中的抗菌活性高于在肉汤中的抗菌活性，这可能是肺泡灌洗液中含有某种抗体或者抑菌因子或其它能增强ADP及ADP-SMZ抗菌活性的成分；通过平板涂布法分别测定ADP和ADP-SMZ复方对H78的最小防耐药突变浓度(Mutant Prevention Concentration，MPC)为20μg/mL和6.4/32μg/mL；将H78暴露在不同浓度的ADP和ADP-SMZ复方1h和2h后，测定H78与ADP孵育1h和2h的抗菌后效应(Post-antibiotic effect， PAE)，分别为0.02h~0.20h和0.40h~0.48h；测定副猪嗜血杆菌与ADP-SMZ复方孵育1h和2h的PAE，分别为0.27h~0.63h和0.46h~1.11h。然后根据MIC测定结果，设置不同浓度的ADP和ADP-SMZ复方药物分别与H78孵育，在不同时间点各取0.1mL，并且通过一系列稀释进行细菌的涂板计数，绘制ADP和ADP-SMZ复方对H78的体外杀菌曲线，通过体外药效学数据看到，ADP单方在临床上治疗效果不理想，在后期的药动学研究中ADP单方仅仅作为对照。最后根据ADP-SMZ复方注射剂给药后不同时间点肺泡灌洗液中的药物浓度，在空白的肺泡灌洗液中添加相应浓度的药物，与H78孵育，绘制半体内的杀菌曲线。其半体内杀菌曲线与体外的杀菌曲线均随着时间的增加，杀菌作用明显增强，与浓度关系不大，表现出明显的时间依赖性，最终选择的PK-PD参数为AUC/MIC。 2艾地普林、磺胺甲噁唑及艾地普林－磺胺甲噁唑复方的药动学研究 首先，建立ADP-SMZ复方药物在猪血浆中和肺泡灌洗液中的高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC)检测方法。然后开始药动学试验，选用健康三元杂交仔猪24头，对ADP-SMZ复方注射剂来说，试验猪分为健康组和患病组，每组6头开展ADP-SMZ复方注射液的药动学试验，患病组需先建立患病模型，即人工感染。然后两组分别以25mg/kgb.w.(以SMZ算)剂量肌内注射给药ADP-SMZ复方注射液，根据文献以及预实验选择合适的时间点采集血浆(Plama)样品和肺泡灌洗液样品，利用HPLC方法分别测定血浆和肺泡灌洗液样品中的药物浓度，结果显示血浆中ADP和SMZ的药物浓度显著低于肺泡灌洗液中的药物浓度，并且该菌在猪发病的主要部位是肺部，会产生肺部病变，故用Winnonlin软件拟合出ADP和SMZ在肺泡液中分别的药动学参数，并以不同时间点采集到的肺泡灌洗液样品作为培养物进行半体内药效学试验，拟合半体内药效学与药动学数据，建立PK-PD结合模型。结果：ADP在健康猪和患病猪中药时曲线下面积(Area under the concentration-time curve，AUC)分别为49.14±0.52h·μg/mL和49.94±0.91h·μg/mL，达峰时间(Peak Time，Tmax)分别为2h和2h，达峰浓度(Peak concentration，Cmax)分别为6.78±0.11μg/mL和6.84±0.25μg/mL，ADP在健康组和患病组中药动学参数无显著差异。SMZ在健康猪和患病猪AUC分别为162.79±12.45h·μg/mL和166.16±12.67h·μg/mL，Tmax分别为2h和2h，Cmax分别为25.44±2.51μg/mL和26.35±2.04μg/mL，SMZ在健康猪和患病猪肺泡灌洗中的药动学参数无显著差异。ADP注射液和SMZ注射液作为ADP-SMZ复方注射液的对照，分别将健康猪分两组，一组肌内注射ADP注射液(5 mg/kg b.w.)，另一组肌内注射SMZ注射液(25 mg/kg b.w.)。同样在与ADP-SMZ复方注射液相同时间点采集肺泡灌洗液样品，然后通过HPLC法测定各个时间点的肺泡灌洗液中ADP和SMZ的药物浓度。ADP和SMZ单方药物的药动学参数结果如下：ADP在健康猪中AUC为44.82±0.52h·μg/mL，Tmax为2h，Cmax为6.88±0.14μg/mL。SMZ在健康猪AUC为199.41±10.14h·μg/mL，Tmax为2h，Cmax为23.4±2.58μg/mL。 3艾地普林-磺胺甲噁唑复方半体内PK-PD模型拟合和给药方案制定 根据药动学参数选择最佳的PK-PD参数，构建ADP-SMZ复方药物对副猪嗜血杆菌的半体内PK-PD模型，通过SigmoidEmax模型方程对半体内杀菌曲线试验中AUC/MIC值和细菌对数变化量之间的关系进行拟合，计算得到患病组中抑菌、杀菌和清除效果下的AUC/MIC值分别为17.81、62.04和37.28h，通过剂量计算公式得到预防、治疗和根治目的下的剂量分别为6.23、21.71和48.05mg/kgb.w。然后使用MlxPlore软件预测得到给药方案每天1次给药，给药3~7天。 综上所述，本课题通过ADP-SMZ复方注射液对副猪嗜血杆菌的药效学-药动学(PK-PD)同步模型研究，制定出了ADP-SMZ复方注射液的给药方案，为临床治疗副猪嗜血杆菌病提供了新的治疗药物和科学合理的给药方案。
艾地普林;磺胺甲噁唑;注射液;副猪嗜血杆菌;PK-PD模型;给药方案;抗菌活性
华中农业大学
硕士
基础兽医学
郝海红
2020
中文
S858.28
2020-12-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）