白花丹醌诱导肝细胞癌凋亡与自噬及其信号调控研究
目的：本研究以人肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404为研究对象，探究：白花丹醌对人肝癌细胞凋亡和自噬的影响；基于PI3K/p38MAPK信号通路研究白花丹醌诱导人肝癌细胞凋亡与自噬的机制。阐明白花丹醌诱导人肝癌SMMC-7721细胞与人肝癌BEL-7404细胞凋亡与自噬的潜在分子机制，为白花丹醌抗肝癌研究领域的开发提供更多的科学依据。 方法：MTT法检测各组肝癌细胞活力及增殖率。同时，为了研究白花丹醌对肝癌细胞凋亡的促进作用，将SMMC-7721细胞分别与凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死抑制剂IM-54孵育后用白花丹醌处理，并与空白对照组分析比较；吖啶橙/溴乙锭双染色观察肝癌细胞的细胞凋亡小体以及酸性自噬泡(AVOs)的形成；使用透射电镜观察细胞的凋亡与自噬形态；免疫荧光技术检测各组肝癌细胞自噬蛋白LC3的表达情况；实时荧光定量PCR技术检测自噬相关基因Beclin1、ATG5、ATG7的mRNA表达水平；免疫印迹法(Western Blot)检测肝癌细胞自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG5、ATG7蛋白)及PI3K/Akt/mTOR通路及p38MAPK信号通路相关蛋白(PI3K、Akt、mTOR、p38MAPK蛋白)的表达。 结果：提高白花丹醌干预肝癌细胞的药物浓度，延长药物的作用时间后发现，人肝癌SMMC-7721细胞与BEL-7404细胞的增殖活力随药物浓度的升高和作用时间的延长逐渐下降，同时，肝癌细胞的凋亡率也随着白花丹醌浓度的升高而上升，呈时间-浓度依赖关系；吖啶橙/溴乙锭双荧光染色发现，经白花丹醌处理的细胞显示亮红色荧光强度显著增加，包括凋亡小体和自噬泡形成；使用透射电镜观察肝癌细胞的形态学改变，发现白花丹醌处理后的肝癌细胞出现明显自噬形态学特征；这表明白花丹醌诱导SMMC-7721细胞中自噬溶酶体的形成，并促进细胞凋亡；免疫荧光显示，用白花丹醌处理过的细胞中LC3蛋白的红色荧光相对集中，LC3蛋白表达水平的增加表明白花丹醌可以诱导SMMC-7721细胞自噬；实时荧光定量PCR与免疫印迹法(Western Blot)的结果显示，提高白花丹醌作用于细胞的药物浓度，SMMC-7721细胞自噬相关蛋白Beclin1、ATG5、ATG7的mRNA和蛋白表达水平显著提高；此外，免疫印迹法(Western Blot)的结果还表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt、mTOR蛋白磷酸化的表达量随白花丹醌浓度的增高逐渐下降，并具有统计学意义。提示白花丹醌可能通过下调Akt、mTOR蛋白的磷酸化，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路来激活肝癌细胞自噬；p38MAPK信号通路与自噬密切相关。和白花丹醌组对比，LC3-II蛋白的表达量明显提高，同时，p38的蛋白磷酸化的表达量明显降低，并具有统计学意义(p<0.05)，提示在人肝癌SMMC-7721细胞与BEL-7404细胞中，白花丹醌可能通过抑制p38MAPK信号通路来激活自噬。 结论：白花丹醌可明显抑制人肝癌SMMC-7721细胞与BEL-7404细胞增殖并诱导细胞凋亡，并呈时间-浓度依赖效应；白花丹醌能够诱导人肝癌细胞发生自噬，其分子机制可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR与p38MAPK信号通路的蛋白磷酸化，激活人肝癌SMMC-7721细胞和BEL-7404细胞自噬的发生。这对拓展白花丹醌治疗肝脏恶性肿瘤领域，提高肝癌患者的生存率，都有积极重大的研究价值。
肝细胞癌;细胞凋亡;白花丹醌
广西中医药大学
硕士
中西医结合基础
韦燕飞
2020
中文
R735.7;R730.2
2020-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）