基于CRISPR序列分型的鸭疫里默氏杆菌疫苗菌株筛选方法的建立及应用
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)属接触类传染性疾病，感染多数禽类，发病后造成纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎等症状。侵害1-8周龄鸭，对养鸭业造成极大威胁。 本研究旨在建立一种高效疫苗菌株筛选方法，和传统疫苗菌株筛选方法相比大幅度降低了工作量和成本，为疫苗研制工作提供有力的技术手段。具有强致病力的菌株通常免疫保护效果较好，在某种细菌研究背景知识模糊，毒力因子尚不明确时，疫苗菌株的筛选方法通常的是，依次对各个分离株进行毒力的测定，常用不同剂量的细菌感染动物，通过测定最小致死量(MLD)或半数致死量(LD50)，还可以用最小感染量(MID)或半数感染量(EID50)来评价。这些方法都需要将临床分离的细菌一一测定，工作量较大，比较费时费力，限制了对比菌株的数量。因此建立一种高效疫苗菌株筛选方法对疫苗研制工作有举足轻重的影响。 本研究方法以鸭疫里默氏杆菌为例，以某集团实验室保存的若干RA菌株为样本，利用鸭疫里默氏杆菌的CRISPR序列作为识别标签，设计引物RAC2-F/RAC2-R并能够成功扩增不同血清型RA的CRISPR序列，效率达94.74%；在此基础上建立了混合菌株感染的攻毒模型；为确定优势菌种突破鸭血脑屏障的最快速时间，混合感染后梯度设置从鸭脑部分离RA时间，分别为3h、6h、9h、12h，综合评价平板上分离RA效率和RA生长情况，攻毒后分离RA的时间确定为6h；利用3个不同血清型的4个RA菌株进行预试验，筛选优势菌种效率达100%。随后以1型RA菌株为例，进行了A-D4组平行试验，各组最优势菌种为FJ-HJH、FJ-LYP、GD-DCR、R9，最优势菌种在各组分离RA的占比分别为83.3%、75%、100%、77.8%，筛选效率理想。 为探究筛选出的优势菌种与毒力间是否存在对应关系，分别对四组最优势菌种进行LD50测定，FJ-HJH、FJ-LYP、GD-DCR、R9的LD50值分别为3.40×105、1.15×106、1.91×104、1.43×105CFU/只；并将四株最优势菌种再次混合感染鸭，结果显示分离RA菌株序列与GD-DCR序列一致性达77.8%，与R9一致的序列占比11.1%，与FY-HJH一致的序列占比11.1%。筛选效率与菌株毒力呈现对应关系，可得出结论，优势菌株毒力较强；为探究菌株毒力与耐药性间关系，选取优势菌种与组内随机挑选出的其他菌种进行药敏试验，结果显示并无显著差异，从本研究结果显示毒力强弱与耐药性间可能无关联。 综上所述，本研究成功建立起基于CRISPR序列分型的鸭疫里默氏杆菌疫苗菌株筛选方法，筛选效率较理想，为高效筛选疫苗菌株提供有力的技术手段；本试验所筛选的优势菌株可应用到鸭疫里默氏杆菌疫苗研发制备工作中；验证了优势菌种为强毒力菌株，在鸭的免疫反应中，优先突破血脑屏障；并且探究了菌株毒力与耐药性之间的联系。
鸭疫里默氏杆菌;疫苗菌株筛选;CRISPR序列;混合感染;LD50测定
河北科技师范学院
硕士
兽医
刘军发;周庆丰
2020
中文
S852.61
2020-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）