转录因子Oct4和Sox9对拟穴青蟹Vih转录调控的初步研究
卵黄发生抑制激素（VIH）是甲壳类高血糖激素（CHH）家族成员之一，在调节甲壳动物的性腺发育和成熟中起着重要作用。然而目前有关于蟹类VIH基因的转录调控机制还没有得到充分的研究。本研究在课题组前期工作的基础上，通过EMSA Supershift实验证实了拟穴青蟹（Scylla paramamosain）SpVih启动子关键区域与转录因子Oct4和Sox9结合。构建Oct4和Sox9基因过表达质粒和SpVih核心启动子片段载体，通过细胞瞬时转染和双荧光素酶报告基因检测实验、在体RNA干扰实验和GST pulldown实验探究转录因子Oct4和Sox9对SpVih的转录调控。主要研究结果如下： 1）利用EMSA Supershift技术，设计包含Oct4和Sox9等转录因子可能结合的序列（-1377/-1316）作为EMSA的探针，在青蟹眼柄核蛋白中分别加入人Oct4和Sox9抗体进行EMSA Supershift实验，证明了转录因子Oct4和Sox9与SpVih关键调控区之间存在特异性结合。 2）构建SpVih基因5’上游调控区序列-1373bp至+213bp（本研究中命名为SpVih-4）报告基因表达质粒和转录因子Oct4和Sox9过表达质粒共转染至HEK293T细胞中，通过双荧光素酶报告基因检测发现Oct4与Sox9都对SpVih有正调控作用并呈浓度效应。 3）体外转录Oct4、Sox9和阴性对照EGFP的dsRNA并将它们和空白对照组无菌生理盐水（Stroke-physiological saline solution，SPSS）分别注射到拟穴青蟹的眼柄基部，收集样品后通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测Oct4和Sox9的干扰效果以及干扰Oct4和Sox9后对青蟹体内SpVih表达水平的影响，结果证明，干扰青蟹体内的Oct4和Sox9能显著抑制青蟹眼柄内SpVih的表达。 4）在对青蟹进行Oct4和Sox9RNA干扰的基础上，检测青蟹卵巢与肝胰腺内卵黄蛋白原基因SpVtg的mRNA表达水平，qRT-PCR结果显示，与空白对照组SPSS和阴性对照组dsEGFP相比，Oct4和Sox9干扰组中卵巢和肝胰腺内的SpVtg表达水平都显著上升，进一步说明了Oct4和Sox9对SpVih的正调控作用。 5）通过原核表达对Oct4和Sox9进行体外重组表达和纯化，获得带GST标签的Oct4重组蛋白和带His标签的Sox9重组蛋白并进行Western blot验证，确定了带GST标签的Oct4蛋白和带His标签的Sox9蛋白纯化成功。 6）对原核表达获得的两个标签重组蛋白进行GST pulldown实验，通过SDS-PAGE和Western blot检测，确定了两个转录因子Oct4和Sox9之间存在直接的相互作用。
蟹类学;转录因子;卵黄发生抑制激素;基因转录;调控机制
集美大学
硕士
水产
王艺磊
2020
中文
Q959.223.630.6
2020-11-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）