牛磺酸干预斜带石斑鱼离体肝细胞脂肪沉积的转录组与蛋白质组学分析
本实验以斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肝原代培养细胞为实验材料，建立原代培养肝细胞脂肪沉积模型，进而对该模型进行牛磺酸干预实验，收集牛磺酸干预后的肝细胞样本，应用转录组学和蛋白质组学方法获得对照组、高脂组和牛磺酸组的差异表达基因和差异表达蛋白质，用以挖掘牛磺酸参与斜带石斑鱼肝脂代谢的关键基因和蛋白质，构建代谢网络，阐明相关分子作用机制。实验内容主要包括以下四部分： 1.斜带石斑鱼原代培养肝细胞脂肪沉积模型的构建 为建立斜带石斑鱼原代培养肝细胞脂肪沉积模型，本实验测定了油酸作为诱导剂的适宜作用浓度和作用时间。培养原代肝细胞时，油酸作用浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8mmol/L，每个浓度下的作用时间分别为24h和48h。之后收集样本测定细胞存活率，细胞内的甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量及培养上清液中的谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）活性，以确定适宜的油酸浓度和诱导时间。结果显示，0.4mmol/L油酸诱导48h时对细胞存活率无显著影响（P>0.05），细胞内TG和TC含量，培养上清液中的GPT和GOT活性显著升高（P<0.05），且油红O染色观察到细胞有明显的橘红色脂滴。因此，斜带石斑鱼原代培养肝细胞脂肪沉积模型建立所需的油酸作用浓度和作用时间分别为0.4mM和48h。 2.牛磺酸干预石斑鱼原代培养肝细胞脂肪沉积的生化效应分析 利用建立的斜带石斑鱼原代培养肝细胞脂肪沉积模型，进行牛磺酸干预实验。实验设对照组、油酸组、油酸+不同浓度牛磺酸（1、2、3、4mmol/L）组，各处理组培养48h之后收集细胞和培养上清液用于生化分析。结果显示，油酸组细胞内TG和TC含量及培养上清液中的GPT和GOT活性均显著高于对照组（P<0.05），牛磺酸干预后的肝细胞内TG和TC含量随牛磺酸作用浓度增加而呈先下降后升高趋势，且在牛磺酸浓度为2mmol/L时达到最低，培养上清液中的GPT和GOT活性随牛磺酸干预浓度升高而降低。可见，2mmol/L的牛磺酸浓度对斜带石斑鱼原代培养肝细胞脂肪沉积具有较好的干预效果。 3.牛磺酸干预斜带石斑鱼原代培养肝细胞脂肪沉积的转录组学分析 分别收集对照组（Control）、高脂组（High-fat，0.4mM油酸）和牛磺酸组（Taurine,0.4mM油酸+2mM牛磺酸）的肝细胞样品，再分别提取总RNA，进行转录组测序，总共得到586804392条Reads，Clean Reads所占比例为98.90%。通过组装共得到99634条Unigene，Unigene平均序列长度为1890bp。利用Blast将Unigene与六大数据库进行比对，得到注释的Unigene数为69982条。通过比对发现，Control组与High-fat比对组共有1831个差异表达基因；High-fat与Taurine比对组共有526个差异表达基因。通过对差异表达基因进行GO功能和KEGG pathway富集分析发现，PPAR信号通路、脂肪酸延伸、初级胆汁酸生物合成、甘油磷脂代谢、AMPK信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路等相关通路是牛磺酸缓解斜带石斑鱼肝细胞脂肪沉积的关键通路。 4.牛磺酸干预斜带石斑鱼原代培养肝细胞脂肪沉积的蛋白质组学分析 运用TMT蛋白定量技术，对Control组、High-fat组和Taurine组的蛋白进行定量分析，共鉴定出7858个蛋白。High-fat与Control比对组共有11个差异表达蛋白（其中，8个上调，3个下调）；Taurine与High-fat比对组共有1076个差异表达蛋白（其中，上调1040个，下调36个）。通过对差异表达蛋白进行KEGG pathway和GO功能富集分析发现，牛磺酸主要通过影响胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、糖酵解/糖异生途径、甘油磷脂代谢途径等糖脂代谢相关通路中的蛋白质表达，进而影响斜带石斑鱼肝细胞的脂肪沉积。
水产饲料;牛磺酸;肝细胞;脂肪沉积;转录组学;蛋白质组学
集美大学
硕士
水产
叶继丹
2020
中文
S963.73
2020-11-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）