EGFR蛋白L858R位点突变的单链抗体筛选及鉴定
目的： 构建全人源单链抗体(single chain fragment variable，SCFV)噬菌体展示文库并对其进行滴度测定及多样性分析，通过亲和筛选获得亲和力高的靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)蛋白L858R位点突变单链抗体的序列。 方法： 1.收集10份正常人外周血，分离出外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）获取总RNA后反转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），再利用PCR等方法扩增出单链抗体重链可变区（variable of heavy chain,VH）和轻链可变区（variable of light chain，VL）基因拼接成单链抗体，并克隆入噬菌粒载体pComb3后电转化入大肠杆菌TG1，在辅助噬菌体及外包装作用下，建成全人源SCFV噬菌体抗体库；2.把EGFR-L858R作为靶标抗原利用酸洗脱法，经“结合一洗脱一扩增”步骤进行多轮淘选；3.筛选出的单克隆进行酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）鉴定，阳性单克隆送至测序公司进一步分析。 结果： 1.成功构建出库容量约为1×109的全人源SCFV噬菌体展示文库，文库阳性率及多样性等均合格。 2.以EGFR-L858R蛋白为靶标抗原，利用酸洗脱法通过2轮富集筛选及初步鉴定得到10株阳性单克隆。 3.对10株阳性单克隆进行测序分析得到6条靶向EGFR蛋白L858R位点突变的人源SCFV序列。 结论： 本研究成功构建出全人源SCFV噬菌体抗体文库，经过富集筛选及初步鉴定获得了靶向EGFR蛋白L858R位点突变单链抗体的序列。可进一步应用于相关恶性肿瘤的免疫治疗，为CAR-T疗法治疗实体肿瘤提供了新的思路及材料基础。
单链抗体;EGFR蛋白;L858R位点;基因突变;抗肿瘤作用
西安医学院
硕士
肿瘤学
白俊
2020
中文
R979.1
2020-11-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）