KRAS蛋白p.G12S位点突变的单链抗体筛选及鉴定
KRAS基因是RAS家族中最易激活的癌基因之一，17%-25%的肿瘤具有激活的KRAS基因突变。致癌的KRAS基因激活突变的关键区域主要为第12、13、59、61和63密码子。这些突变被激活的方式是通过失活内源性GTP酶活性并引起GTP酶活性蛋白抵抗，从而使GTP结合态的RAS蛋白含量增高。在我国肿瘤患者中，KRAS基因突变位点主要为第2号外显子12号和13号密码子。其中以p.G12D和p.G13D位点点突变为主，也可见p.G12S点突变等。KRAS基因突变在不同类型的肿瘤中也不尽相同，诸如结直肠腺癌和非小细胞肺癌的患者中，在一定程度上其不同的基因位点突变与患者的预后相关。利用基因工程等方式筛选针对某位点突变的特异性单链抗体能够为制定个性化靶向治疗策略提供理论依据。 随着肿瘤的生物治疗不断发展，有效的特异性靶向治疗的抗体药物，在提高药物有效率的同时能够大大降低药物产生的毒副作用。目前，新型的靶向药物如西妥昔单抗和一些免疫检查点抑制剂等已经应用于多种肿瘤的靶向及免疫治疗并取得了良好的结果。但是对于存在RAS基因特定位点突变的肿瘤，多种靶向药物则难以达到预期的治疗效果。因此寻找特异性的针对特定位点突变的抗体，对肿瘤的生物治疗具有极其重要的意义。目前肿瘤免疫相关理论均认为在肿瘤患者体内必然存在着肿瘤特异性抗原，能够诱发机体产生针对肿瘤的免疫反应，理论上机体能够产生针对特异性抗原的特异性抗体。但是，寻找肿瘤特异性抗原和相应的抗体是十分困难的事情。 单链抗体是利用基因工程的方法将传统抗体的轻链可变区和重链可变区通过一段核苷酸链拼接而成的重组蛋白，它具有分子量小，免疫原性低，穿透力强，定位迅速，且易于基因工程制备和改造等优点，非常适合用于肿瘤靶向治疗。而20世纪90年代出现的噬菌体展示技术则为噬菌体抗体库的建立奠定了理论基础。同时使肿瘤相关单链抗体的发现和制备成为可能。想获得高亲和力的特异性抗体，主要取决于两个重要的决定因素：抗体库的库容和制备来源，理想的抗体筛选应该出自尽可能大的库容并直接来源于人体，但因为条件所限，多数相关研究较难同时具备这两点。 目的： 本研究拟通过基因工程和噬菌体展示技术构建人源性噬菌体单链抗体库，以期从中筛选出具有高亲和力和特异性的针对KRAS p.G12S位点突变的单链抗体，为肿瘤的诊断及基因靶向治疗提供新的方案。 方法： 收集10例健康的志愿者外周血，并签署知情同意书，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR等方法扩增出多样性的单链抗体重链和轻链可变区片段并构建单链抗体基因库，将噬菌体质粒双酶切，与双酶切后的单链抗体基因库相连接，再将连接产物电转化入大肠杆菌TG1，构建初级单链抗体库；2.以基因重组表达的含有p.G12S的蛋白为靶抗原，通过多轮洗涤，筛选出具有高亲和力的特异性抗该位点突变的单链抗体，并对其结构序列进行分析；3.通过ELISA等方法，鉴定获得的单链抗体的亲和力和特异性，以及蛋白的基本表达情况。 结果： 利用基因工程和分子克隆的相关技术，成功构建了库容量约为1×1013的初级噬菌体单链抗体库，且所获得抗体具有良好的多样性；2.以重组表达的含有p.G12S的蛋白为靶抗原，利用噬菌体展示的方法，通过2轮淘洗，成功构建具有高亲和力的抗p.G12S位点突变的单链抗体库，通过酶切、核酸测序等方法比对，判定所得单链抗体基因的轻重链序列是否与人IgG抗体轻重链可变区序列具有高度同源性（＞90%）。 结论： 构建出1013库容的人源性初级单链抗体库 筛选出具有高亲和力和特异性的针对KRAS蛋白p.G12S位点突变的单链抗体。
单链抗体;KRAS蛋白;p.G12S位点;基因突变;抗肿瘤作用
西安医学院
硕士
肿瘤学
白俊
2020
中文
R979.1
2020-11-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）