纳米金杂化脂肪酶催化拆分反应研究
脂肪酶是一种绿色安全的重要工业酶制剂，因其良好的底物特异性，可以催化多种反应，广泛应用于油脂加工、医药、香料等许多工业领域。农副产品和微生物是脂肪酶的重要来源，由于天然脂肪酶存在稳定性差、立体选择性不理想和难以重复使用的问题，适用范围受到很大限制。本文以皱褶假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL）为模型酶，利用纳米金（Gold nanoparticles，AuNPs）优异的生物相容性以及独特的理化性质，提出了两种新型杂化酶策略，制备CRL-AuNPs杂化酶应用于拆分(R,S)-萘普生甲酯，显著提高了产物的光学纯度和脂肪酶操作稳定性。文中改善脂肪酶性质的方法也可应用于农副产品来源的脂肪酶，为扩大脂肪酶的人工目的性改性提供了理论支持，主要研究内容和结果如下： 构建酶促拆分反应体系，以100mg的CRL为催化剂在微水相中进行手性拆分，于35℃反应96h。实验结果表明转化率(C)为23.2%，产物对映体过量值(eep)为94.8%，对映体比率(E)为50.3。采用高效液相色谱对反应剩余底物和水解产物定性分析。在不可逆动力学拆分条件下，建立了参数方程并据此绘制C与ees和eep的理论曲线图。 利用柠檬酸钠还原氯金酸形成不同粒径AuNPs，CRL与AuNPs在离子键和物理吸附的共同作用下获得CRL-AuNPs①杂化酶，研究结果显示，在10mL浓度为10mg/mL的CRL酶液中加入60mL平均粒径为14nm的纳米金，杂化温度为30℃，杂化时间为24h时制备的杂化酶拆分效果最好。此时拆分反应C为20.0%，eep为97.3%，E为94.1。并利用紫外、荧光、FTIR、TEM等检测手段对制备成功的CRL-AuNPs①杂化酶进行表征并探究其二级结构的变化。 利用CRL上的还原性氨基酸原位还原氯金酸一步合成CRL-AuNPs②杂化酶，利用紫外、荧光、FTIR、TEM、XPS等手段对制备的CRL-AuNPs②杂化酶进行表征，通过透射电镜观察到AuNPs呈圆球形均匀分散，XPS结果表明Au4f7/2和Au4f5/2结合能分别为83.5和87.2eV，证明Au(Ш)已还原为Au(0)。拆分结果表明，杂化最优条件为取10mL浓度10mg/mL的CRL酶液与1mL浓度1mg/L的氯金酸溶液，放入转速100rpm温度30℃的摇床，杂化15h获得CRL-AuNPs②杂化酶，此条件下杂化酶C为21.4%，eep为98.6%，E为179.3。 对最优制备条件下的CRL-AuNPs①和CRL-AuNPs②杂化酶进行催化特性分析，CRL-AuNPs①和CRL-AuNPs②杂化酶分别保留了CRL纯酶86.2%和92.2%的活性，E值与游离酶相比提高了87.1%和256.5%，经过6次反复批式反应后酶活力分别保持在初始值的57.3%和69.4%，且CRL-AuNPs②的立体选择性几乎未改变。研究发现经AuNPs杂化改造后的脂肪酶，二级结构发生变化，导致立体选择性显著提高，稳定性有所提升，便于重复使用。
脂肪酶;纳米金杂化;二级结构;拆分反应;催化性能
哈尔滨商业大学
硕士
农产品加工及贮藏工程
辛嘉英
2020
中文
TQ426.6
2020-10-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）