味蕾组织传感器与甜味受体T1R2纳米传感器对照研究
作为一种G蛋白偶联受体，T1R2主要负责甜味传感，而甜味作为人类最喜欢的味道则是刺激进食的一种重要的―激励机制。经验证明：具有甜味的天然化学成分主要由糖类物质构成，属于碳源营养。可见甜味传感主要是促使人类寻找和摄取足够的碳源来满足自身的生长、发育和生命活动要求。这在人类长期生存、繁衍和进化中无疑具有重要意义。在食品行业，为了对不同甜味成分进行定量化评价，科学家将蔗糖的甜度定为―1‖，其它甜味物质通过不同的稀释度、不同人群品尝和同一浓度的蔗糖溶液进行比较得出其―甜度。目前所研制并使用的测量甜度的仪器，如电子舌主要依据这些―品味出来的甜度。在食品加工和生产中，往往也都是为了迎合人们对甜度的追求，将低甜度的葡萄糖转变为高甜度的果糖等。但是随着生活水平的不断提高，人们对甜味的过度追求，摄取的卡值和碳营养普遍过剩，从而导致―代谢综合征-肥胖、糖尿病、高血压、高血脂等现代文明病的流行。已知人类传感甜味是通过味蕾细胞上的甜味受体T1R2(hT1R2)识别甜味成分，然后激活细胞内的信号传递，开启或关闭细胞的钙离子通道，产生细胞膜的去极化作用，所产生的电信号进一步激活附近的末梢神经，最终将受体-配体识别信号通过鼓索神经传递到大脑的甜味味觉中枢，从而感知甜味。可见对hT1R2受体-甜味配体识别、细胞信号传递和神经信号发生与传递进行系统研究，不仅有望建立起一套定量化评价甜味的传感器系统，而且对于揭示人类甜味传感机制、细胞信号传导、甜味与健康的关系等都具有重要的理论意义和广阔的应用前景。 在NCBI官网查询(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)检索hT1R2受体基因的DNA序列，合成该基因，并将其插入真核细胞表达载体pcDNA3.1获得重组质粒。用脂质体转染法将t1r2-质粒通过Lipofectamine2000转入HEK-293T细胞，通过HEK-293T细胞表达系统获得hT1R2受体蛋白。利用hT1R2受体组装成双层纳米金-硫堇-壳聚糖-传感器，利用辣根过氧化物酶作为信号放大系统。用时间电流法对10种不同甜味成分进行测定。结果显示：hT1R2双层纳米金受体传感器与不同甜味成分呈现类似酶促反应的动力学特征。在此基础上进行双曲线模型拟合，其皮尔逊相关系数均达到0.95以上。参照酶促反应米氏常数的双倒数法(Lineweaver-Burk方程)测定得到各种甜味物质的联动变构激活常数(Ka)，R2≥0.95，分别为：麦芽糖的变构常数Ka值为3.533×10-11mol/L；甘露醇的变构常数Ka值为1.159×10-11mol/L；山梨糖醇的联动变构常数Ka值为4.766×10-12mol/L；蔗糖的联动变构常数Ka值为1.1×10-13mol/L；木糖醇的联动变构常数Ka值为1.037×10-13mol/L；阿斯巴甜的联动变构常数Ka值为8.509×10-15mol/L；糖精钠的联动变构常数Ka值为9.878×10-14mol/L；糖精的联动变构常数Ka值为6.799×10-14mol/L；三氯蔗糖的联动变构常数Ka值为7.545×10-15mol/L；索马甜的变构常数Ka值为5.729×10-15mol/L。证明体外表达的hT1R2可以用来构建纳米金受体传感器，而且经过信号放大可以对10种不同甜味剂的重要动力学参数进行超敏感测定。 但是，纳米金hT1R2受体与不同配体联动变构所产生的这些参数能否代表hT1R2在味蕾上传感甜味成分，进而激活胞内信号传递途径控制味蕾细胞钙离子通道，产生细胞去极化以及进一步产生脉冲信号到大脑甜味中枢是本研究必需解决的一个关键性难题。为此，本研究进一步将hT1R2自组装到T1R2缺陷型猫味蕾组织上，成功研制出hT1R2自组装猫味蕾组织传感器。实验结果表明：味蕾组织与10种不同甜味剂同样呈现酶促反应动力学特征，然后使用双曲线模型进行拟合，相关系数均达到0.95以上。用双倒数法求出联动变构激活常数(Ka值，R2≥0.95)：麦芽糖的变构常数Ka值为7.904×10-12mol/L；甘露醇的变构常数Ka值为1.0039×10-11mol/L；山梨糖醇的变构常数Ka值为2.5769×10-12mol/L；蔗糖的变构常数Ka值为8.882×10-13mol/L；木糖醇的变构常数Ka值2.7838×10-13mol/L；阿斯巴甜的变构常数Ka值9.961×10-16mol/L；糖精钠的变构常数Ka值为3.348×10-14mol/L；糖精的变构常数Ka值为1.646×10-14mol/L；三氯蔗糖的变构常数Ka值3.878×10-15mol/L；索马甜的变构常数Ka值为3.7207×10-15mol/L。说明hT1R2自组装到猫味蕾组织上能够激活其细胞信号传递，控制钙离子通道开关，细胞去极化，将受体-配体识别信号转化为神经电信号。 接下来的问题是：hT1R2纳米金受体传感器和T1R2缺陷型猫味蕾组织hT1R2自组装传感器所测定的参数Ka值是否相关？这两种传感器所测定的所有10种甜味剂的传感动力学参数是否真实反映了各自的甜度?于是本研究依照韦伯传感定律，将10种甜味剂的甜度和两种传感器所测定的Ka值分别进行转化和比较分析，结果表明：1、两种传感器的Ka值的皮尔逊相关系数为：0.930，P≤9.56?10-5，证明hT1R2通过T1R2缺陷型猫味蕾组织对同样甜味剂表现出基本一致识别和传感作用；2、hT1R2纳米金受体传感器所测定的Ka与甜度值的皮尔逊相关系数为：0.815，P≤4.06?10-3，证明可以用双层纳米金hT1R2受体传感器测定甜味；3、hT1R2自组装猫味蕾组织传感器的Ka和甜度之间的皮尔逊相关系数为：0.918，P≤1.781?10-4，显然：hT1R2自组装到T1R2缺陷型猫味蕾组织传感甜味比hT1R2纳米金受体传感器更接近人类对甜味物质的真实体验，也就是更接近韦伯所得出的传感定律，这不仅证明了hT1R2可以更好地用来进行甜味传感测定，而且可以推测韦伯定律的受体-配体识别-细胞信号传递-钙离子通道开关控制-细胞膜去极化和神经电信号发生和传递机制。
味蕾组织传感器;甜味受体T1R2;纳米传感器;动力学参数;超敏感测定
天津商业大学
硕士
轻工技术与工程
庞广昌
2019
中文
TP212.2;TS207.3
2020-10-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）