IFT122通过初级纤毛介导的Shh信号通路调控mEPMCs增殖的机制研究
目的：本研究拟通过体外实验探索小鼠胚胎腭突间充质细胞（mouse Embryo Palatal Mesenchymal cells,mEPMCs）初级纤毛内转运系统（Intraflagellar Transport,IFT）关键组件IFT122与Shh信号通路的关系以及IFT122调控mEPMCs增殖的机制，试图初步阐明mEPMCs初级纤毛与Shh信号通路在腭发育中的作用，以期为腭裂发生的防治提供前期理论基础。 方法：获取ED13.5的C57BL/6J小鼠胚胎腭突组织，通过酶消化法结合机械分离法获取原代mEPMCs进行体外培养并通过ICC技术对其进行鉴定。利用RNAi技术下调IFT122的表达，通过Real-time PCR和WB技术对其沉默效率进行验证。（1）将mEPMCs分为未作处理的对照组和沉默IFT122的IFT122-Kd组：使用IF技术标记AA-Tub（RFP）观察初级纤毛形成情况，标记Smo（GFP）观察Smo的荧光密度变化；Real-time PCR和WB检测Shh信号通路关键受体Smo和转录因子Gli3的表达变化以及细胞增殖标志物PCNA和细胞周期因子Cyclin D1的表达变化；CCK-8法检测mEPMCs的数量变化。（2）沉默mEPMCs中IFT122的基础上加入SAG，将mEPMCs分为对照组、IFT122-Kd组和IFT122-Kd+SAG组：使用Co-IF技术同时标记AA-Tub（RFP）和Smo（GFP）观察Smo与初级纤毛的共定位变化；Real-time PCR和WB技术检测Smo、Gli3、PCNA和Cyclin D1的表达变化；CCK-8法检测mEPMCs的数量变化。 结果：ICC结果显示mEPMCs中Vim表达阳性，P-CK表达阴性。（1）IF结果显示IFT122-Kd组中初级纤毛发生率降低且长度变短，Smo的荧光密度降低；Real-time PCR和WB结果显示IFT122-Kd组中IFT122、Smo、Gli3、PCNA及Cyclin D1的表达低于对照组；CCK-8结果显示IFT122-Kd组中mEPMCs数量增长速度减慢且在96h数量较之前开始减少。（2）Co-IF结果显示SAG的加入促使Smo大量进入初级纤毛；Real-time PCR和WB结果显示IFT122-Kd+SAG组中Smo、Gli3、PCNA及Cyclin D1的表达相较于IFT122-Kd组增高，但仍低于对照组；CCK-8结果显示IFT122-Kd+SAG组中mEPMCs的数量相较于IFT122-Kd组增多，但仍少于对照组。 结论：（1）沉默IFT122导致mEPMCs初级纤毛生长缺陷； （2）IFT122可通过Shh信号通路参与调控mEPMCs增殖； （3）mEPMCs中Shh信号通路的传导依赖于初级纤毛。
胚胎腭突间充质细胞;初级纤毛内转运系统;Shh信号通路;细胞增殖
遵义医科大学
硕士
口腔基础医学
何苇
2020
中文
R329.2
2020-10-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）