表位加工控制鸡蛋卵类粘蛋白致敏性的研究
目的：通过食品级加工技术获得低致敏卵类粘蛋白产物，探索其表位与致敏性变化的关系，为低致敏或脱敏鸡蛋产品的研发提供理论指导。 方法：1.卵类粘蛋白的分离纯化：新鲜鸡蛋去壳并分离鸡蛋黄后，先通过预处理除去卵粘蛋白等干扰蛋白，再应用CM-Sepharose FF阳离子交换层析法，使卵类粘蛋白先于卵白蛋白洗脱出来，消除卵白蛋白含量大、出峰时间长对卵类粘蛋白纯化的影响，从而获得高纯度卵类粘蛋白。通过电泳和质谱分析进行鉴定，通过灰度分析蛋白纯度。收集纯度大于90%的卵类粘蛋白。 2.卵类粘蛋白的去折叠与烷基化处理：采用谷胱甘肽还原法和半胱氨酸还原法破坏分子内二硫键。根据电泳图谱中各目标条带的泳动率，检测不同还原条件下的去折叠效率及兔血清IgG结合能力，结合与过敏患者血清IgE结合能力确定最优还原条件，制备去折叠卵类粘蛋白用于后续实验。在还原法破坏卵类粘蛋白的二硫键后，由于还原条件的改变或还原剂量降低易导致二硫键重新折叠，因此，在检测前先通过烷基化反应屏蔽巯基，并利用离心浓缩除去过量反应物使结果更精确。 3．美拉德反应影响卵类粘蛋白致敏性条件的优化：加热温度、加热时间、还原糖种类、还原方法的不同以及还原糖的比例等是美拉德反应重要的影响因素。先通过单因素实验确定影响卵类粘蛋白致敏性的因素，然后根据结果来判断是否需要继续通过响应面法进行优化，将反应条件最优的卵类粘蛋白产物用于下一步研究。 4．糖化卵类粘蛋白免疫反应性的评估：将去折叠前后的卵类粘蛋白糖化并诱导其重新折叠，通过间接EILSA或竞争抑制ELISA检测去折叠前后卵类粘蛋白的兔血清IgG结合能力和鸡蛋过敏患者血清IgE结合能力，选择结合能力最低的糖化产物，通过圆二色谱、紫外光谱和荧光光谱分别分析其二级和三级结构特征，通过与烷基化卵类粘蛋白比对，确定卵类粘蛋白重新折叠发生；通过与未处理卵类粘蛋白比对，确定二硫键是否在原来的位置重新形成。 5．动物实验评估卵类粘蛋白产物致敏性：用低IgE结合卵类粘蛋白产物免疫小鼠，通过观察小鼠过敏症状、检测致敏小鼠血清中IgE,IgG,IgG1,IgG2a的水平、检测脾细胞IL-4，IL-10，IL-13等细胞因子水平的变化等完成动物实验评估。 结果：1.卵类粘蛋白的分离纯化：经过一个完整的分离过程（2h），可以收集到14.33mg卵类粘蛋白，得率为45.8%，纯度为94.1%，显示出与卵类粘蛋白标准品相似的免疫活性。 2．最佳还原条件：选择谷胱甘肽作为还原剂，还原剂浓度为1mg/ml时，产物与小鼠血清IgG及人血清IgE结合能力下降最显著。 3．去折叠卵类粘蛋白结构变化：二级结构发生改变，主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，荧光光谱结果显示疏水性改变。 4．最佳糖化条件：麦芽糖与卵类粘蛋白赖氨酸残基比例为10∶1，加热温度为90℃，加热时间为8h时，与兔血清IgG结合能力结果显示该糖化条件加工后的卵类粘蛋白（G-M-OVM）的IC50值由0.3741μg/ml上升到112.6μg/ml，与过敏患者血清IgE结合能力检测结果显示G-M-OVM相比于未加工的卵类粘蛋白（OVM）IgE结合能力显著下降（P＜0.05）。 5．卵类粘蛋白的重新折叠：诱导重新折叠的卵类粘蛋白未完全在原来的位置发生折叠。 6．动物实验评估：小鼠血清特异性抗体IgE、IgG、IgG1和IgG2a水平相比于未加工的卵类粘蛋白组小鼠均下降（P＜0.05）。与未加工的卵类粘蛋白比较，加工后的卵类粘蛋白刺激脾脏产生的IL-4，IL-17A和IFN-γ的水平均下降（P＜0.05）。 结论：1．本研究开发了一种简单方便的色谱方法，可以在2小时内分离出高纯度的卵类粘蛋白，与商业卵类粘蛋白标准品具有相似的免疫活性，可以用于实验室研究。 2．通过去折叠-糖化-重新折叠获得低致敏卵类粘蛋白产物。
鸡蛋;卵类粘蛋白;表位加工;致敏性分析
遵义医科大学
硕士
卫生毒理学
黄厚今;麻小娟
2020
中文
TS253.4
2020-10-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）