盐霉素通过TGFβ1/Smad信号通路调节MMP--2、9 降低CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞迁移和侵袭能力
目的： 采用无血清培养技术（Serum free medium,SFM）培养MCF-7细胞株，创建CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞（BCSC）体外模型，分析其生物学特性，为后续实验提供研究平台；检测盐霉素（Salinomycin,SAL）对该细胞亚群迁移及侵袭能力产生的影响，初步探讨相应的分子生物学机制，为盐霉素作为新型抗肿瘤药物投入临床使用提供理论依据。 方法： 1.创建CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞体外模型，分析其生物学特性：MCF-7细胞株分别用SFM和完全培养基（Complete medium,CM）进行培养，倒置显微镜下观察并拍照记录其细胞形态、生长方式的差异；CM培养悬浮微球体，显微镜下拍照记录其细胞形态和生长方式发生的变化；采用免疫荧光技术、流式细胞仪（Flow cytometry,FCM）检测BCSC表面标志物CD44、CD24的表达差异；流式细胞仪检测BCSC的富集率差异；Transwell检测两种细胞迁移、侵袭能力的差异。 2.盐霉素影响CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞的迁移、侵袭能力，初步探讨相应的分子生物学机制：不同浓度SAL分别培养BCSC、MCF-7细胞24h后，显微镜下拍照记录BCSC细胞形态的变化；MTT法检测SAL对BCSC和MCF-7的增值抑制作用，筛选出盐霉素诱导BCSC24h后，引起细胞凋亡低于50%的SAL浓度；以筛选出的浓度培养BCSC，排除SAL对该细胞增值抑制作用的影响，Transwell检测其迁移和侵袭能力的变化；Western blot技术检测TGFβ1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平的变化。 结果： 1.无血清培养基培养的细胞以大小不等的微球体形式悬浮生长，完全培养基培养的细胞以类似多边形的形式单层附着贴壁生长；BCSC可以悬浮在不含血清的培养基中，同时维持未分化的微球体状态，接触血清之后开始发生分化，伸出伪足，最终恢复附着生长状态；标志物CD44在两种细胞中的表达无明显差异，而微球体中标志物CD24的表达明显减少；CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞在微球体和贴壁细胞中的比例分别87.6%±2.7%和19.28%±2.57%（P＜0.05），CD44+/CD24+表型细胞的比例分别是11.23%±2.94%和79.75%±2.92%（P＜0.05）；Transwell结果显示，与MCF-7细胞相比，BCSC的迁移和侵袭能力更强。 2.显微镜下观察，微球体随盐霉素浓度上升，逐渐解体，出现细胞碎片，最终死亡。盐霉素对BCSC和MCF-7细胞株均具有浓度依赖性的增殖抑制作用，盐霉素诱导BCSC24h的半数致死率浓度（IC50）为7.63±0.07μmol/L。Transwell检测结果显示，盐霉素能显著降低BCSC的迁移、侵袭能力，呈浓度依赖性，与DMSO对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot结果显示，TGFβ1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平在盐霉素诱导下明显下调，呈浓度依赖性，与DMSO对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 1.无血清培养技术使MCF-7的细胞形态及生长方式发生变化，CD24标志物表达量减少，迁移、侵袭能力均增强，有效富集CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞。 2.盐霉素有效抑制CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞的体外增殖，显著降低其迁移、侵袭能力，且呈浓度依赖性；盐霉素很有可能通过TGFβ1/Smad信号通路调节MMP-2、9的表达，最终降低CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞迁移、侵袭能力。
乳腺癌干细胞;盐霉素;细胞迁移;细胞侵袭
泰山医学院
硕士
病理学与病理生理学
王学春
2016
中文
R737.9;R979.1
2020-10-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）