人源IFN--γ、IL--12串联共表达载体构建与体外联合诱导CIK细胞的作用
目的： 本课题以人源细胞因子干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白细胞介素-12（Interleukin-12,IL-12）为基础，经由IRES功能元件串联，构建IFN-γ、IL-12单独表达真核载体及IFN-γ-IRES-IL-12串联共表达真核载体，并转染人源胚胎肾上皮细胞HEK293，并通过反转录PCR（RT-PCR）、蛋白质印迹法（Western Blot）及酶联免疫吸附试验（ELISA）等检测方式在目的基因的转录水平和翻译水平上进行确证，使目的基因在HEK293细胞中得以成功表达，通过载体抗性基因neo基因，利用G418对成功转染目的基因的阳性克隆细胞进行筛选，以得到能够稳定表达IFN-γ和IL-12细胞因子的HEK293细胞系，并初步探索联合两种细胞因子诱导人外周血单个核细胞分化为细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer,CIK）的能力，为进一步探讨人源细胞因子诱导的CIK细胞在体内外的抗肿瘤活性奠定基础。 方法： 1.目的基因片段的获取及引物合成 根据GenBank数据库中已经公布了的人源性细胞因子IFN-γ和IL-12（含IL-12A和IL-12B两个亚单位）基因的参考序列，分别对三个目的片段及串联元件IRES设计引物，并于引物5’端附加相应酶切位点，供目的片段与真核表达载体连接使用，目的片段及引物由上海铂尚生物公司合成。 2.重组真核表达载体pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12的构建 PCR扩增目的片段IFN-γ、IL-12A及IL-12B，经2%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化、并将回收后的目的片段与pMD18-T载体连接，对目的片段T载体及真核表达载体pΔSGB-X使用相同的限制性内切酶进行双酶切，分别回收目的片段及线性真核表达载体，经T4DNA连接酶16℃连接过夜，取连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物接种于含卡纳霉素抗性固体LB平板上，37℃温箱培养12小时后挑取优势抗性菌落于LB液体培养基扩增，提取质粒后PCR反应、酶切反应及测序鉴定重组质粒正确与否。 3.重组真核表达载体pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12转染HEK293细胞 重组质粒pIFN-γ、pIL-12和pIFN-γ-IRES-IL-12在脂质体Lipofectamine2000的介导下转染人源细胞HEK293，24小时后检测转染效率，以确定目的基因是否成功导入细胞。 4.G418筛选转染后阳性细胞克隆及稳定表达细胞系的建立 复苏HEK293细胞，并传至96孔板，设置选择培养液中G418浓度梯度，终浓度从0μg/ml-1000μg/ml共11组，分别加入各组HEK293细胞，隔天换液，以2周内细胞全部死亡的G418浓度为筛选转染后阳性克隆的最佳浓度。 HEK293细胞转染重组质粒24h后，分别将转染不同质粒组细胞传至细胞瓶中，并添加含G418的选择培养基，隔天换液培养至14天左右，筛选稳定表达目的蛋白IFN-γ和IL-12的HEK293细胞系。 5.目的基因IFN-γ和IL-12转录及翻译水平的鉴定 提取筛选后HEK293细胞总RNA，经RT-PCR、PCR检测目的基因在HEK293细胞中的转录水平；提取细胞总蛋白，经Western Blot检测HEK293细胞中目的蛋白IFN-γ及IL-12在细胞内翻译水平；取HEK293细胞培养上清液，通过ELISA检测目的蛋白IFN-γ及IL-12在HEK293细胞中的表达及外分泌水平。 6.IFN-γ和IL-12联合诱导CIK细胞能力的鉴定 淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞，并于体外培养，隔天加入含IFN-γ和IL-12细胞因子的细胞培养上清液，对细胞进行诱导分化，体外培养一周后，收集细胞后CD3和CD56抗体染色，流式细胞仪鉴定细胞表型变化。 结果： 1.真核表达载体pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12的构建 成功构建的三种真核表达载体pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12。经质粒PCR和双酶切反应，2%琼脂糖凝胶电泳后显示目的条带与预期大小一致，测序鉴定目的基因序列完全正确，无错配、缺失及移码等。 2.重组质粒转染HEK293细胞结果 转染重组质粒24小时后，荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率，荧光图片显示含增强绿色荧光蛋白（EGFP）的阴性对照组在荧光显微镜下约有20%的细胞发绿色荧光，与流式细胞仪检测结果基本一致，表明重组质粒已经成功转染至HEK293细胞。 3.稳定表达目的蛋白HEK293细胞系的建立 经G418敏感性实验证实当选择培养液G418终浓度在600μg/ml以上时，未转染的HEK293细胞在2周内全部死亡，故对成功转染重组质粒的细胞进行稳定筛选时G418终浓度为600μg/ml。转染24小时后，更换G418终浓度为600μg/ml的选择培养基，7天后见大量细胞死亡，换液后去除死亡细胞继续G418加压筛选至14天，见成片细胞形成，即为阳性细胞克隆而来，传至新的细胞瓶继续培养后冻存备用。 4.目的基因IFN-γ和IL-12转录水平及翻译水平的鉴定 RT-PCR检测结果证实转染重组质粒组中IFN-γ、IL-12A和IL-12B三个目的片段mRNA的转录明显高于阴性对照组，表明目的片段在HEK293细胞中转录成功。Western Blot检测证实转染共表达质粒组分别在17kDa和70kDa左右检测到目的蛋白表达，与预期蛋白分子量大小一致。转染共表达质粒组IFN-γ的表达量明显高于IL-12的表达量。ELISA检测证实目的蛋白在HEK293细胞内实现可分泌性表达，转染共表达质粒组细胞上清中同时检测到细胞因子IFN-γ及IL-12，且细胞因子IFN-γ的表达量高于IL-12，与Western Blot检测结果一致。 5.IFN-γ和IL-12联合诱导CIK细胞能力的鉴定 流式细胞仪检测培养后的单个核细胞CD3+CD56+双阳性的细胞为10.6%±2.1%，明显高于阴性对照组1.8%±0.3%，经统计学分析，P＜0.05，可认为两种细胞因子具有联合诱导外周血单个核细胞分化为CIK细胞的能力。 结论： 1.成功构建pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12真核重组质粒。 2.重组质粒pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12在人源细胞HEK293中成功表达，并能成功分泌到细胞外。 3.研究证实转染重组质粒的HEK293细胞表达的细胞因子IFN-γ和IL-12可以联合诱导人外周血单个核细胞分化为CIK细胞，为下一步CIK细胞的体内外抗肿瘤活性的测定奠定了基础。
恶性肿瘤;自体细胞免疫疗法;细胞因子干扰素-γ;白细胞介素-12;真核表达载体
泰山医学院
硕士
病原生物学
于爱莲;王玉
2016
中文
R730.51
2020-10-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）