YAP1基因在HCMV致绒毛外细胞滋养细胞功能低下作用机制的体外研究
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）又被称为人类疱疹病毒5型，一种常见的是疱疹病毒科β亚科病毒，在自然界中广泛存在，人是HCMV的唯一宿主。HCMV是引起孕妇活动性感染、造成胚胎及胎儿宫内感染的目前已知的最常见病原体之一。妊娠期间母体感染HCMV后，可通过生殖道逆行或胎盘垂直传播至胎儿，造成宫内感染。HCMV引起的宫内感染可导致胚胎流产、停育、早产死胎、胎儿宫内发育迟缓等不良妊娠结局，以及新生儿智力低下、感音神经性耳聋等严重并发症。HCMV引起宫内传播和造成胎儿发育异常的具体途径及机制尚不清楚，目前认为HCMV启动宫内感染的第一步是感染胎盘滋养细胞。流产、死胎等异常妊娠的病理机制是绒毛外细胞滋养细胞（extra villous cytotrophoblast，EVT）增殖、侵袭能力下降，导致螺旋动脉重铸不良，胎盘物质交换功能低下。 近几年，于果蝇中发现的Hipoo信号转导通路受到越来越多的关注，而且多项研究表明Hippo信号通路在调控细胞增殖及器官发育方面具有重要作用，其中Yes相关蛋白（Yes associated protein，YAP1）在该信号通路起关键作用，是Hippo信号通路下游的一种重要的蛋白、转录共激活因子。根据相关研究发现YAP1在正常细胞生长发育过程中在细胞核内与转录因子TEAD结合，通过促进下游靶基因的表达以发挥其促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用，最终可调节器官的大小及肿瘤形成[36]。YAP1表达水平过高可导致细胞过度增殖、器官异常增大甚至肿瘤的发生，因此YAP1基因为候选的癌基因。YAP1表达水平降低导致器官萎缩、组织再生能力降低。 绒毛外细胞滋养细胞的浸润、侵袭能力类似肿瘤细胞，但它和肿瘤细胞不同，它的浸润和侵袭能力具有特异的时间性和空间性。 由之前的实验发现，EVT感染HCMV后细胞中的YAP1蛋白表达下降，细胞的侵袭能力降低。推测HCMV感染EVT至其侵袭功能下降的机制可能是通过调控Hippo信号通过的关键蛋白YAP1来实现的。 目的： 通过检测HCMV体外感染EVT的细胞中的YAP1基因表达水平，初步探究YAP1基因在HCMV导致绒毛外细胞滋养细胞增殖、侵袭功能低下中的作用。 方法： 1.实验分组为正常组（EVT）、病毒组（HCMV）、YAP1干扰组（siRNA）、YAP1过表达组(质粒)； 2.通过预实验筛选YAP1siRNA和过表达质粒的最佳转染浓度和时间，按照最佳转染浓度和时间转染EVT用RT-PCR、免疫荧光、Western-blot检测转染后YAP1的变化以及、及对这种变化对EVT侵袭力的影响； 3.荧光定量PCR检测EVT组、HCMV组、siRNA组及过表达组经Hippo信号通路对EVT表达Mst1、Mst2、SAV、Lats1、Lats2、Mob1、YAP1、TAZ、TEAD1-4、MMP9、MMP2mRNA水平的影响； 4.免疫荧光化学染色法、Western Blot方法检测EVT组、HCMV组、siRNA组、过表达组细胞中YAP1蛋白表达的影响； 5.本实验通过体外细胞侵袭实验，研究感染HCMV、转染siRNA及过表达质粒后，对EVT体外侵袭功能的影响。 结果： 1.QT-PCR结果显示，EVT组、HCMV组、过表达组和siRNA组EVT中均有Mst1、Mst2、SAV、Lats1、Lats2、Mob1、YAP1、TAZ、TEAD1-4、MMP9、MMP2基因mRNA，各基因mRNA相对表达量EVT组为（1.000±0.014,1.000±0.036,1.000±0.025,1.001±0.047,1.000±0.016,1.001±0.067,1.002±0.067,1.000±0.017,1.001±0.053,1.001±0.050,1.000±0.039,1.009±0.1601.000±0.034,1.000±0.027）；HCMV组为（0.805±0.015,0.818±0.027,0.929±0.021,0.721±0.032,0.734±0.005,0.388±0.019,0.623±0.022,0.587±0.012,0.488±0.010,0.501±0.012,0.652±0.016,0.625±0.026,0.635±0.046,0.0632±0.015)，HCMV组与EVT组相比较，各基因mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）；过表达组（1.542±0.058,1.624±0.01,1.681±0.041,1.832±0.004,1.932±0.003,1.622±0.034,3.581±0.034,1.479±0.03,2.305±0.010,0.806±0.020,0.982±0.090,1.007±0.034,1.252±0.217,1.310±0.045），过表达组与EVT组相比较，各基因mRNA表达水平明显升高（P＜0.05）；siRNA组为（0.726±0.006,0.806±0.010,0.955±0.034,0.713±0.021,0.809±0.020,0.534±0.017,0.594±0.065,0.664±0.013,0.610±0.020,0.650±0.020,0.717±0.013,0.671±0.041,0.852±0.005,0.946±0.013）siRNA组与EVT组相比较，各基因mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。 2.Western blot检测结果显示EVT组和HCMV组都有YAP1蛋白的表达。与EVT组相比较，HCMV组和siRNA组表达YAP1蛋白水平明显降低（P＜0.05），过表达组EVT表达YAP1蛋白水平升高（P＜0.05）； 3.体外细胞侵袭实验结果显示，EVT组、HCMV组、siRNA组、过表达组均有细胞穿过Madrigal基质胶，明显穿膜细胞数分别为EVT组（55.7±2.95）个、HCMV组（47.9±2.95）个、siRNA组（42.6±2.14）和过表达组（66.8±2.34），与EVT组相比较HCMV组、siRNA组穿膜细胞数明显减少（P＜0.05），过表达组明显增多（P＜0.05），提示HCMV感染降低EVT侵袭活力，YAP1基因与EVT侵袭力相关； 4.上调YAP1基因后发现，与EVT组相比Mst1、Mst2、SAV、Lats1、Lats2、Mob1、YAP1、TAZ、TEAD1-4、MMP9、MMP2等基因mRNA的表达水平明显上升（P＜0.05）；沉默YAP1基因后，各基因mRNA均表达降低（P＜0.05）。 结论： EVT中的YAP1基因参与HCMV致早孕绒毛外细胞滋养细胞侵袭、增殖功能低下的病理过程，HCMV可能通过影响Hippo信号通路中的多个环节，导致Hippo信号通路中各基因的mRNA及关键蛋白YAP1蛋白表达降低，进一步导致EVT细胞侵袭功能下降可能是引起自然流产的机制之一。
妊娠期;人巨细胞病毒感染;绒毛外细胞滋养细胞功能低下;YAP1基因;基因表达
泰山医学院
硕士
妇产科学
于新艳
2016
中文
R714.251
2020-10-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）